《Nature》|碧云天助力揭示小鼠学习记忆关键机制

N6甲基腺苷,即m6A,是广泛存在于哺乳动物信使RNA(mRNA)上的一种甲基化修饰,它最早发现于20世纪七十年代,但是直到2011年首个m6A去甲基化酶被鉴定出来以及m6A测序技术的兴起,才使得人们意识到这一修饰可能同DNA甲基化一样具有重要的调控作用并开始研究它的生物学功能。

在神经系统中,m6A的含量十分丰富,与许多神经功能相关。虽然含有m6A的mRNA在许多生理过程中都会定向降解,但是m6A是如何影响mRNA的翻译并发挥重要的生物学功能还很不清楚。

 

11月1日,上海科技大学周涛研究组、芝加哥大学何川教授课题组以及宾夕法尼亚大学宋红军教授课题组联合作在Nature杂志上发表了题为m6A facilitates hippocampus-dependent learning and memory through YTHDF1的研究论文,在RNA甲基化(m6A)调控学习与记忆功能的研究领域取得重要进展,首次揭示了m6A通过其识别蛋白YTHDF1调控小鼠空间学习与记忆能力的分子机制。

研究人员为了探索m6A修饰对于大脑学习和记忆功能的调控机制,利用CRISPR/Cas9技术构建了YTHDF1(m6A识别蛋白)敲除小鼠,接着对小鼠进行行为学分析与电生理实验,并进行了局部基因敲低及过表达、m6A测序、RNA测序等研究。结果表明,基础状态下,YTHDF1对mRNA的表达调控作用很小,但在神经元被激活后,却对mRNA的表达发挥重要的调控作用。另外,学习后,YTHDF1蛋白会富集到突触后致密物中。YTHDF1可能通过调控突触的局部翻译效率,从而影响突触可塑性,进一步影响记忆的形成。

这一研究结果首次揭示了在响应外界刺激的条件下,m6A通过YTHDF1促进了海马脑区相关mRNA的翻译。这一研究不仅发现了m6A在体内对于学习记忆的重要调控功能,也揭示了RNA对学习和记忆的调控机制,为研究学习与记忆过程背后的详细分子机制提供了新的方向,也为深入揭示m6A的生物学功能和调控机制开拓了一条新的道路。

 

本研究通过Western Blot实验验证了YTHDF1缺陷型小鼠的成功构建,并检测了YTHDF1上下游蛋白的表达量的改变。在蛋白样品的制备过程中,使用了碧云天的SRIPA裂解液(强)(货号P0013B)。后续的SDS-PAGE中也使用了碧云天的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) (货号P0015F)

产品编号 产品名称 产品包装
P0013B RIPA裂解液(强) 100ml
P0015F SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(6X) 2ml

RIPA系列裂解液一直是碧云天的明星产品,对于绝大部分的Western检测,Western及IP细胞裂解液(P0013)RIPA裂解液(强)(P0013B)都能取得非常理想的裂解效果,该系列产品已经被数百篇文献所使用。

具体参见以下链接中的“相关论文”页签http://beyotime.com/product/P0013B.htm

虽然看似基础,但在不同实验中,研究人员往往需要根据后续实验步骤、蛋白定位、蛋白稳定性,以及可耐受的离子强度等众多因素,来选择正确的裂解液。为了让研究人员能够更轻松地选择裂解液,碧云天结合多年的研发经验,针对性地开发了系列裂解产品。

研究人员按照下表按图索骥即可选择出最适合自己的产品。

产品编号 P0013 P0013B P0013C P0013D P0013F P0013G P0013J P0013K
产品名称 Western及IP细胞裂解液 RIPA裂解液(强) RIPA裂解液(中) RIPA裂解液(弱) NP-40裂解液 SDS裂解液 Western及IP细胞裂解液(无抑制剂) RIPA裂解液(强,无抑制剂)
有效裂解成分 1% Triton X-100 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS 1% NP-40, 0.5% deoxycholate, 0.1% SDS 1% NP-40, 0.25% deoxycholate 1% NP-40 1% SDS 1% Triton X-100 1% Triton X-100, 1% deoxycholate, 0.1% SDS
裂解强度 温和 温和 温和 温和
对膜蛋白的提取 一般 很好 较好 一般 一般 很好 一般 很好
对胞浆蛋白的提取 很好 很好 很好 很好 很好 很好 很好 很好
对核蛋白的提取 较好 很好 较好 较好 较好 很好 较好 很好
胞浆磷酸化蛋白提取 很好 很好 很好 很好 很好 很好 很好 很好
细胞核转录因子提取 很好 很好 很好 很好 很好 很好 很好 很好
含蛋白酶抑制剂
是否推荐添加PMSF(ST506/ST505) 推荐 推荐 推荐 推荐 推荐 推荐 酌情添加 酌情添加
是否推荐添加蛋白酶抑制剂混合物(P1005-P1031) 添加更好 添加更好 添加更好 添加更好 添加更好 添加更好 酌情添加 酌情添加
含磷酸酯酶抑制剂
是否推荐添加蛋白酶磷酸酶抑制剂混合物(P1045-P1066) 添加更好 添加更好 添加更好 添加更好 添加更好 添加更好 酌情添加 酌情添加
是否推荐添加磷酸酶抑制剂混合物(P1081-P0197) 添加更好 添加更好 添加更好 添加更好 添加更好 添加更好 酌情添加 酌情添加
是否需要添加去乙酰化酶抑制剂混合物(P1112/P1113) 酌情添加 酌情添加 酌情添加 酌情添加 酌情添加 酌情添加 酌情添加 酌情添加
主要用途 WB, IP, co-IP WB, IP WB, IP WB, IP, co-IP WB, IP, co-IP WB, ChIP WB, IP, co-IP WB, IP

如果您觉得看表过于繁琐,碧云天也给您提供一个简明小贴士:

  • Western及IP细胞裂解液(P0013)的操作最简单,裂解强度适中。
  • Western及IP细胞裂解液(P0013)效果不理想,可尝试RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40裂解液。
  • 若IP背景高,即非特异的蛋白也被IP下来,可以选用裂解强度较高的裂解液,例如RIPA裂解液(强或中)。
  • 若目的蛋白无法被IP下来,可以使用较为温和的裂解液,例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。
  • 若目标蛋白较难溶解,可以尝试裂解强度较高的裂解液,例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。

SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(SDS-PAGE Sample Loading Buffer,6X),是一种经过改良的以溴酚蓝为染料,6倍浓缩的蛋白上样缓冲液。按照每5微升蛋白样品加入1微升蛋白上样缓冲液(6X)的比例,混合蛋白样品和蛋白上样缓冲液(6X), 100℃或沸水浴加热3-5分钟,即可充分变性蛋白。

参考文献:

1. Jia, G., Fu, Y., Zhao, X., Dai, Q., Zheng, G., Yang, Y., ... & He, C. (2011). N6-methyladenosine in nuclear RNA is a major substrate of the obesity-associated FTO. Nature Chemical Biology 7(12), 885.
2. Yoon, K. J. et al. (2017).Temporal Control of Mammalian Cortical Neurogenesis by m6A Methylation. Cell 171, 877.
3. Wang, Y. et al. N6-methyladenosine RNA modification regulates embryonic neural stem cell self-renewal through histone modifications.(2018). Nat Neurosci 21, 195.
4. Wang, C.-X. et al. METTL3-mediated m6A modification is required for cerebellar development.(2018). PLOS Biology 16, e2004880.
5. Widagdo, J. et al.(2016). Experience-Dependent Accumulation of N6-Methyladenosine in the Prefrontal Cortex Is Associated with Memory Processes in Mice. J Neurosci 36, 6771.
6. Merkurjev, D., Hong, W. T., Iida, K., Oomoto, I., Goldie, B. J., Yamaguti, H., ... & Pellegrini, M. (2018). Synaptic N 6-methyladenosine (m6A) epitranscriptome reveals functional partitioning of localized transcripts.Nature Neuroscience 1.
7. Weng, Y. L., Wang, X., An, R., Cassin, J., Vissers, C., Liu, Y., ... & Joseph, J. (2018). Epitranscriptomic m6A regulation of axon regeneration in the adult mammalian nervous system. Neuron 97(2), 313.