CELL|碧云天产品助力相分离对NLRP6炎症小体激活作用研究

近年来，液液相分离被证实参与多种细胞生物学过程，例如在免疫过程中，dsDNA诱导的环状GMP-AMP合酶相分离能够增强cGAMP的产生，促进STING和I型干扰素的激活。同时有报道表明NLRP6在宿主免疫过程中也具有重要作用，其参与炎症小体激活和干扰素的产生过程。

2021年11月11日，哈佛大学医学院吴皓课题组联合中国科学技术大学朱书课题组在《Cell》杂志发表题为“Phase separation drives RNA virus-induced activation of the NLRP6 inflammasome”的研究论文。研究人员发现dsRNA能够诱导NLRP6发生相分离，从而激活炎症小体，产生抗病毒免疫反应。动物实验结果显示，NLRP6缺失或NLRP6^k350-354A突变小鼠炎症小体激活减少，说明NLRP6中多聚赖氨酸序列(K350-354)突变对其相分离及炎症小体激活过程十分重要。与此同时，LTA等其他NLRP6配体也参与液液相分离过程。说明不同配体与NLRP6结合后都会诱导NLRP6相分离，促进NLRP6在不同细胞环境中发挥不同生物学功能。

此前已有研究表明NLRP6存在多种潜在配体，包括dsRNA、LTA、LPS和微生物相关代谢产物牛磺酸和精胺等。研究人员利用MST实验测定了各种配体与NLRP6的亲和力强度，结果显示dsRNA与NLRP6结合最强(K_D=1.2±0.2μM)，并且dsRNA长度越长，其与NLRP6的亲和力也越强。此外，LTA也能够与NLRP6结合，但亲和力稍弱(K_D=6.5±0.8μM)。随后通过EMSA实验，研究人员发现，NLRP6中仅NACHT区域和LRR区域参与调控dsRNA与NLRP6的结合过程。

在上述实验中，研究人员注意到，当加入dsRNA后，NLRP6溶液出现了浑浊现象，因此研究人员推测可能发生了相分离过程。为了证实这一猜想，研究人员构建了mCherry-NLRP6和FAM-60bp dsRNA，二者混合后，利用荧光显微镜观察可以看到明显的液体聚集体。通过荧光漂白恢复实验以及凝聚体融合实验，研究人员进一步证实dsRNA与NLRP6的确通过液液相分离形成了液滴凝聚体。

为进一步研究dsRNA与NLRP6液液相分离的机制，研究人员发现NLRP6蛋白序列中含有多个内在无序区(IDR)，并且通过相关光遗传学实验证实，部分IDR对于液液相分离的形成具有重要意义。随后，研究人员以IDR中多聚赖氨酸和多聚精氨酸区域为目标，构建了相应突变体及稳定表达对应突变蛋白的MEF细胞，通过一系列体外实验及细胞实验发现，赖氨酸突变体会明显抑制NLRP6的液液相分离。同时功能试验表明，突变体与野生型相比，会明显抑制NLRP6炎症小体的激活。上述结果证实，NLRP6中多聚赖氨酸区域是启动液液相分离，完成后续炎症小体激活的关键，多价相互作用是液液相分离的关键作用力。

随后研究人员在小鼠体内验证液液相分离过程对NLRP6炎症小体激活及对病毒感染的抑制作用。实验结果显示MHV感染后，与Nlrp6^-/-小鼠相比，野生型小鼠肝脏切片中观察到了清晰的dsRNA-NLRP6凝聚体，并且野生型小鼠GSDMD剪切及IL-18分泌增多，而病毒拷贝数则显著低于Nlrp6^-/-小鼠，说明NLRP6炎症小体的激活能够显著抑制小鼠肝脏病毒感染。同时，研究人员还构建了NLRP6^K350-354A突变小鼠模型用于研究LLPS对于病毒感染的抑制作用。结果显示，NLRP6^K350-354A突变小鼠与Nlrp6^-/-小鼠结果相似，均出现了凝聚体形成减少，GSDMD剪切和IL-18分泌降低，且炎症小体激活异常等现象。上述结果证实，NLRP6的液液相分离作用对炎症小体的激活和抑制病毒感染具有重要作用。

在研究中，研究人员选用了碧云天高品质DAPI染色液产品，用于所有切片中细胞核的定位染色。

产品编号	产品名称	产品包装
P0131-5ml	抗荧光淬灭封片液(含DAPI)	5ml
P0131-25ml	抗荧光淬灭封片液(含DAPI)	25ml

论文链接：
Shen et al., Phase separation drives RNA virus-induced activation of the NLRP6 inflammasome, Cell 2021
https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.09.032