碧云天生产的LwaCas13a，也称C2c2，是由碧云天自主研发的PerfectProtein™技术平台表达、纯化获得的一种由RNA引导并靶向RNA的重组核酸内切酶。

CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)是一种原核生物利用RNA引导的核酸酶对外源的噬菌体或病毒核酸进行基因沉默的获得性免疫系统(Adaptive immune system)，后续在此基础上逐渐发展为广泛应用于原核和真核生物的CRISPR/Cas基因编辑技术。基于crRNA效应复合物中的Cas蛋白，CRISPR-Cas系统分为两类。第Ⅰ类CRISPR-Cas系统利用多蛋白效应复合物发挥作用，目前其可分为3种类型和12种亚型；而第Ⅱ类CRISPR-Cas系统只需用单一的Cas效应蛋白即可对外源核酸序列进行识别和切割，目前其可分为3种类型和9种亚型。第Ⅱ类CRISPR-Cas系统由于作用机制简单，因此受到广泛关注，其中CRISPR-Cas9系统属于第Ⅱ类Ⅱ型，CRISPR-Cas12a系统属于第Ⅱ类Ⅴ型[2]，CRISPR-Cas13a系统属于第Ⅱ类Ⅵ型。 Cas9和Cas12在DNA基因编辑中已经得到非常广泛的应用；最近发现Cas13在RNA调控中起重要作用，目前Cas13已应用于转录组工程、病毒干扰、核酸检测和RNA成像等方面[1]。

LwaCas13a来源于Leptotrichia wadei菌株，分子量约为140kDa，与其它Ⅱ类CRISPR-Cas效应物不同，LwaCas13a缺乏DNA酶结构域，但具有高等真核生物和原核生物中与核苷酸结合(Higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide-binding, HEPN)的两个结构域，这两个结构域参与RNA切割。除此之外，Cas13a识别的不是PAM (Protospacer adjacent motif)序列，而是PFS (Protospacer flanking site)位点；LwaCas13a对于PFS位点均没有偏好(即A、U、G、C均可)，而来源于其它菌株的Cas13a则偏好于A、U、C [3]。

LwaCas13a会通过两种方式展现其核糖核酸酶活性；一种是通过特异性方式激活顺式剪切(cis-cleavage)，LwaCas13a在crRNA引导下识别并切割靶标单链RNA (Single strand RNA, ssRNA)；另一种是通过非特异性方式激活反式剪切(trans-cleavage)，当LwaCas13a与crRNA、靶标ssRNA三者结合形成三元复合物后，便会被激活针对非特异ssRNA的反式剪切活性，即LwaCas13a蛋白不仅能够切割靶标ssRNA，还能将反应体系中的任意序列单链RNA切碎，参考图1。基于该原理，Broad研究所的张锋团队开发了名为SHERLOCK (Specific High-Sensitivity Enzymatic Reporter Unlocking)的核酸快速检测工具[4]。

图1.碧云天LwaCas13a核酸酶作用原理示意图。

碧云天LwaCas13a酶活性检测效果参考图2。

图2.碧云天LwaCas13a (D0517)和G公司的LwaCas13a酶活性检测对比效果图。6.5μl Nuclease-free Water、1μl 10X Reaction Buffer、1μl crRNA (0.75pmol)、1μl LwaCas13a (分别为1.6、0.4、0.1、0.025pmol)和0.5μl RNase Inhibitor (40U/μl)，在37ºC预孵育10分钟；然后在10μl的预孵育反应体系中加入8μl Nuclease-free Water、1μl 10X Reaction Buffer、1μl靶标ssRNA (2pmol)形成20μl反应体系，在37ºC孵育30分钟；再加入1μl Proteinase K (20mg/ml) (ST533)，室温孵育10分钟以终止反应；最后加入4μl DNA上样缓冲液(6X) (D0071)，进行2%的琼脂糖凝胶电泳检测。crRNA与LwaCas13a结合后，引导后者至靶标ssRNA产生酶切，ssRNA被切割后降解。如图所示，本产品与G公司的LwaCas13a具有相近的酶活性。实际检测效果会因样品、具体实验条件等的不同而存在差异，本图仅供参考。

来源：通过E.coli重组、表达、纯化而获得，表达基因来源为Leptotrichia wadei。

用途：可用于体外RNA切割、体外RNA检测、活细胞RNA调控、RNA基因编辑、光学探针生物学标记等。

纯度：不含DNA内切酶和外切酶，不含自身之外的RNA酶。

浓度：35μM (约5mg/ml)。

酶储存溶液：20 mM Tris-HCl, 300mM NaCl, 1 mM DTT, 50% (v/v) Glycerol, pH8.0 @ 25ºC。

10X Reaction Buffer：400mM Tris-HCl, 600mM NaCl, 60mM MgCl2, pH7.3 @ 25ºC。

-20ºC保存，至少一年有效。分装后在-80ºC可以保存更长时间，须尽量避免反复冻融。

本产品使用过程中需要确保Nuclease-free，操作时应特别小心，避免被污染。所有操作都需要按照RNase-free的要求进行。

对于操作环境中核酸酶的去除，推荐使用碧云天生产的RNase and DNase Away (R0123)以去除实验桌面上或其它接触面上的核酸酶。反应体系中推荐加入RNase Inhibitor以保护RNA不被降解。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。