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核酸相关> DNA操作> 修饰酶
phi29 DNA Polymerase
产品编号: D7053S
产品包装:250U
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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D7053S phi29 DNA Polymerase 250U 158.00元
D7053M phi29 DNA Polymerase 1kU 498.00元
D7053L phi29 DNA Polymerase 5kU 1898.00元
D7053XL phi29 DNA Polymerase 20kU 5998.00元

碧云天生产的phi29 DNA Polymerase,即phi29 DNA聚合酶,是一种重组表达纯化的源于嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus subtilis噬菌体phi29的DNA聚合酶。phi29 DNA聚合酶具有DNA链置换 (strand displacement) 活性和很强的DNA连续合成能力(processive synthesis property),可以合成超过70kb的长度,常用于在体外进行不依赖于热循环的等温DNA扩增(isothermal DNA amplification,也常简称为等温扩增)。

phi29 DNA Polymerase具有很强的链亲和力,单次聚合反应可以实现长度超过70kb的连续聚合延伸,从而适合用于对全基因组进行稳定扩增。phi29 DNA Polymerase虽然可以扩增线状或者环状的双链DNA,但其底物倾向于是单链DNA或单链RNA。phi29 DNA Polymerase具有3’→5’外切酶活性,因此可保证扩增反应的高保真性。

用途:phi29 DNA Polymerase可用于高保真等温PCR、滚环复制(Rolling Circle Replication,RCA),多重置换扩增(Multiple Displacement Amplification,MDA)和单细胞、病原微生物以及宏基因组(metagenome)的全基因组扩增(Whole Genome Amplification,WGA)、干血斑样本扩增DNA、单细胞基因组扩增、SNP基因分型和STR/微卫星分析等。phi29 DNA Polymerase还可应用于protein-primed DNA扩增、RNA-primed DNA扩增,以及致死基因的无细胞体系的克隆等相关实验。

碧云天生产的phi29 DNA Polymerase在3-16小时内可实现对动物细胞基因组、环状质粒以及线性单链DNA的有效扩增(图1,图2和图3)。

图1. 碧云天生产的phi29 DNA Polymerase和国外N公司的同类产品(Competitor phi29 DNA Polymerase)催化Hela细胞基因组DNA扩增效果对比图。图A为30℃孵育2h效果图,图B为30℃孵育16h效果图。反应体系为20μl:2μl 10X Reaction Buffer,1μl Random Hexamer Primer (100 μM),1μl dNTP (2.5 mM each),1μl Hela细胞基因组DNA (20 ng/μl),14μl Nuclease-free Water,95℃孵育5 min,冰浴2 min后加入1μl不同稀释倍数 (1、2、4、8、16倍稀释)的phi29 DNA Polymerase,反应完毕后,加入4μl 6X DNA Loading buffer (D0071, Beyotime),取10μl反应产物,使用1%琼脂糖凝胶电泳检测其扩增效果。1. 未添加Hela细胞基因组DNA但加入正常量的phi29 DNA Polymerase;2. 未添加phi29 DNA Polymerase;3-7分别为phi29 DNA Polymerase的稀释倍数为1、2、4、8和16倍。从上图的检测效果来看,碧云天生产的phi29 DNA Polymerase能很好地扩增基因组DNA,并且其扩增效果优于国外N公司的同类产品。

来源:碧云天生产的phi29 DNA Polymerase由大肠杆菌重组表达Bacillus subtilis噬菌体phi29 DNA Polymerase,并通过纯化所得,该酶分子量约为67kDa。

活性定义:One unit is defined as the amount of enzyme that will incorporate 0.5 pmol of dNTP into acid insoluble material in 10 minutes at 30℃。

图2. 碧云天生产的phi29 DNA Polymerase和国外N公司的同类产品(Competitor phi29 DNA Polymerase)催化环状质粒DNA pCMV-N-DsRed (4959bp, D2705)扩增效果对比图。图A为30℃孵育2h效果图,图B为30℃孵育16h效果图。反应体系为20μl:2μl 10X Reaction Buffer,1μl Random Hexamer Primer (100 μM),1μl dNTP (2.5 mM each),1μl 5kb环状质粒DNA (pCMV-N-DsRed,5 ng/μl),14μl Nuclease-free Water,95℃孵育5 min,冰浴2 min后加入1μl不同稀释倍数 (1、2、4、8、16倍稀释)的phi29 DNA Polymerase,反应完毕后,加入4μl 6X DNA Loading buffer (D0071),取10μl反应产物,使用1%琼脂糖凝胶电泳检测其扩增效果。1. 未添加pCMV-N-DsRed但加入正常量的phi29 DNA Polymerase;2. 未添加phi29 DNA Polymerase;3-7分别为phi29 DNA Polymerase的稀释倍数为1、2、4、8和16倍。从上图的检测效果来看,碧云天生产的phi29 DNA Polymerase能很好地扩增质粒,并且其扩增效果优于国外N公司的同类产品。

图3. 碧云天生产的phi29 DNA Polymerase和国外N公司的同类产品(Competitor phi29 DNA Polymerase)催化线性单链DNA扩增效果对比图。图A为反应2h效果图,图B为反应16h效果图。反应体系为20μl:2μl 10X Reaction Buffer,1μl Random Hexamer Primer (100 μM),1μl dNTP (2.5 mM each),1μl M13单链DNA (5ng/μl),14μl Nuclease-free Water,95℃孵育5 min,冰浴2 min后加入1μl不同稀释倍数(1、2、4、8、16倍稀释)的phi29 DNA Polymerase。反应完毕后,加入4μl 6X DNA Loading buffer (D0071, Beyotime),取10μl反应产物,使用1%琼脂糖凝胶电泳检测其扩增效果。1. 未添加M13单链DNA但加入正常量的phi29 DNA Polymerase;2. 未添加phi29 DNA Polymerase;3-7分别为phi29 DNA Polymerase的稀释倍数为1、2、4、8和16倍。从上图的检测效果来看,碧云天生产的phi29 DNA Polymerase能很好地扩增单链DNA,并且其扩增效果优于国外N公司的同类产品。

10X Reaction Buffer:500 mM Tris-HCl (pH7.5 at 25℃), 100 mM MgCl2, 100mM (NH4)2SO4 , 40 mM DTT。

酶储存溶液:10 mM Tris-HCl (pH7.4 at 25℃), 100 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 50% (v/v) Glycerol, 0.5% Tween20,0.5% Nonidet P-40。

纯度:不含DNA内切酶活性和RNase活性,不含蛋白酶活性。

失活或抑制:65℃热孵育10min即可失活。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D7053S-1 phi29 DNA Polymerase (10U/µl) 25µl
D7053S-2 10X Reaction Buffer 100µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7053M-1 phi29 DNA Polymerase (10U/µl) 100µl
D7053M-2 10X Reaction Buffer 300µl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7053L-1 phi29 DNA Polymerase (10U/µl) 500µl
D7053L-2 10X Reaction Buffer 1.5ml
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7053XL-1 phi29 DNA Polymerase (10U/µl) 2ml
D7053XL-2 10X Reaction Buffer 6ml
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,至少一年有效。

注意事项:

DTT浓度对于phi29 DNA Polymerase活力影响较大,当10X Reaction Buffer储存时间较长或经反复冻融后,可在反应体系中补充DTT至终浓度为5 mM。

由于phi29 DNA Polymerase具有较强的3’→5’外切酶活力,建议合成引物时对其3’端进行硫代磷酸酯键修饰,或使用高浓度的随机引物,以降低外切酶活力对引物的切割效应。

phi29 DNA Polymerase具有很高的灵敏度及扩增效率,请使用Nuclease-free的枪头和PCR管,并避免其它反应组分污染。建议在进行扩增反应的同时设置无DNA模板的阴性对照,以确保无外源DNA的污染。若阴性对照出现背景,请先将整个反应体系,除了DNA模板和phi29 DNA Polymerase外,先95℃加热变性2min,然后置于冰浴冷却,随后加入phi29 DNA Polymerase,混匀后30℃孵育30min,以充分利用phi29 DNA Polymerase的外切酶活性去除污染的DNA模板背景,然后再加入DNA模板样品进行预期的扩增。

对于酶的操作需在冰浴上进行,以避免酶在室温长时间放置而影响酶的活性。

进行等温扩增时,需自备额外的试剂,例如如2.5 mM dNTP、Random Hexamer Primer (100μM)以及Nuclease-free Water等。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.参考下表,在冰浴上配制反应体系。
Reagent Volume Final Concentration
Nuclease-free Water (15-x)µl -
10X Reaction Buffer 2 µl 1X
dNTP (2.5 mM each) 1 µl 125µM
Random Hexamer Primers (100μM) 1 µl 5μM
Template DNA (≥1 ng)* x μl -
Total Volume 19µl -
a.上表以20µl体系为例,如果有多个类似反应,可以根据实验需求先配制大体积的反应体系,用移液器轻轻吹打或Vortex混匀后分装到各PCR反应管内。
b.对于基因组DNA,建议模板DNA的终浓度为20ng/µl;对于质粒,建议模板DNA的终浓度为5ng/µl;对于M13单链DNA,建议模板DNA终浓度为5ng/µl。
c.由于phi29 DNA Polymerase具有较强的5’→3’外切酶活性,如果出现扩增效果不佳的现象,建议将反应体系中的酶量降低至0.5μl或0.25μl。
2.模板DNA的预变性:将上述反应体系置于PCR仪中95 ℃孵育5min,迅速置于冰浴2min或更长时间。
3.恒温扩增反应:在冷却的反应体系中加入1μl phi29 DNA Polymerase,30℃孵育2-16h。通常孵育2h即可,如果希望获得更大量的扩增产物,可延长孵育时间至16h。推荐使用恒温水浴锅进行反应,如果使用热盖式PCR仪进行反应,请将热盖温度调整为40℃,以避免酶失活。
4.终止反应:65℃孵育10 min。
扩增产物的检测:将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳以检测扩增效果。
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