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核酸相关> 反转录与PCR> PCR相关
Uracil-DNA Glycosylase (E. coli)
产品编号: D7360M
产品包装:5000U
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价格: ¥ 1106.00
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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D7360S Uracil-DNA Glycosylase (E. coli) 1000U 267.00元
D7360M Uracil-DNA Glycosylase (E. coli) 5000U 1106.00元

碧云天生产的Uracil-DNA Glycosylase (E. coli),也称E. coli Uracil-DNA Glycosylase (UDG)或E. coli Uracil N-Glycosylase (UNG),即大肠杆菌UDG或UNG,可催化含尿嘧啶的DNA链中的尿嘧啶(dU)碱基和脱氧核糖之间的N-糖苷键发生水解,从而释放游离尿嘧啶。Uracil-DNA Glycosylase (UDG)可以水解含有dU的单链或双链DNA,但不能水解RNA或含有dU的长度不超过6个碱基DNA寡聚体。

UDG主要应用于消除PCR扩增过程中带来的产物污染问题。其防止污染的原理为:在PCR反应中加入适量的dUTP,以dUTP替代dTTP掺入DNA中,形成含dU碱基的PCR扩增产物;后续进行PCR反应时,使用UDG酶选择性切割可能被污染而带入的之前PCR扩增产生的含有dU的单链或双链DNA,从而避免之前的PCR扩增产物可能的污染对于本次PCR扩增带来的负面影响。

活性定义:One unit is defined as the amount of enzyme that catalyzes the release of 60 pmol of uracil per minute from double-stranded, uracilcontaining DNA. Activity is measured by release of [3H]-uracil in a 50 µl reaction containing 0.2 µg DNA (104–105 cpm/µg) in 30 minutes at 37℃.

碧云天生产的E. coli UDG酶活性鉴定结果可参考图1。

图1.碧云天和N公司E. coli UDG酶催化水解5µl含dU碱基的PCR扩增产物效果图。使用本产品或国外N公司的E. coli UDG,在20µl体系,分别以5µl含dU碱基的1600bp大小的PCR扩增产物为底物和不同量的(0U, 0.0025U, 0.005U, 0.01U, 0.025U, 0.5U) E. coli UDG在1X E. coli UDG Buffer,37℃孵育30min,然后用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。如图所示,本产品与N公司相比,具有相当的酶活。M, DNA marker (D0110 DNA Ladder (0.2-12 kb, 12 bands))。

来源:大肠杆菌重组、表达和纯化而获得。

纯度:不含UDG酶活力之外的内切或外切脱氧核糖核酸酶、RNase和磷酸酶活性。

用途:防止PCR产物的交叉污染;单核苷酸多态性检测(single nucleotide polymorphism detection,GMPD);位点特异性突变;蛋白质与DNA相互作用研究;SNP基因分型;PCR产物的克隆;制备含有单链突出末端的PCR产物或cDNA。

酶储存溶液:10mM Tris-HCl (pH 7.4), 50mM KCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1mg/ml BSA, 50% (v/v) glycerol。

10X E. coli UDG Buffer:200mM Tris-HCl, 10mM EDTA, 10mM DTT, pH 8.0 at 25℃。

失活或抑制:95℃加热10分钟可以使95% E. coli UDG失活。由于经95℃加热10分钟处理后,其仍保持部分活性,建议加入UDG抑制剂(如来自枯草芽孢杆菌噬菌体PBS2的Ugi蛋白或噬菌体phi29的p56蛋白)进一步抑制其酶活以免其继续降解含有dU的PCR产物。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D7360S-1 E. coli UDG (5U/µl) 200µl
D7360S-2 10X E. coli UDG Buffer 2ml
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7360M-1 E. coli UDG (5U/µl) 1ml
D7360M-2 10X E. coli UDG Buffer 10ml
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,至少一年有效。

注意事项:

E. coli UDG酶在大多数PCR反应缓冲液体系中均有活性,但对于自行使用的PCR或RT-PCR体系,首次使用时建议先测试一下是否和所使用的体系兼容。通常取含dUTP的PCR扩增产物,参考图1加入适量UDG,观察能否有效降解含dUTP的PCR扩增产物。

dNTP/dUTP推荐选购碧云天的D7376 dNTP/dUTP Mixture (2.5mM each/5mM)

E. coli UDG酶消化产生的DNA链的无碱基位点可通过加热,碱处理或核酸内切核酸酶处理而除去。通常PCR反应过程中的加热步骤可以确保UDG酶消化的位点被完全剪切开。

E. coli UDG酶在比较宽泛的pH范围内具有活性,其最适pH值为8.0,E. coli UDG酶活不需要二价阳离子,并被高离子强度(> 200 mM)所抑制。

E. coli UDG酶可以在PCR反应前清除不慎污染的含dUTP的PCR产物,从而避免由于污染导致的PCR假阳性结果。

E. coli UDG在加热变性后可能由于重折叠而在较低温度下表现出残留活性。因此,建议在退火步骤中使用55℃或更高的温度进行后续PCR。

E. coli UDG可以用于DNA或cDNA的常规PCR或qPCR扩增体系,但通常不建议用于RT-PCR体系。因为在反转录条件下,通常E. coli UDG会保持活性,并可能消化新合成的cDNA。

E. coli UDG酶经95℃加热10min处理后,仍会保持少量活性,如果希望用于RT-PCR体系,需要反转录和PCR分开进行,在反转录时不使用dUTP,在反转录后加入E. coli UDG酶处理,然后进行常规的PCR或qPCR,或者建议加入UDG抑制剂(如来自枯草芽孢杆菌噬菌体PBS2的Ugi蛋白或噬菌体phi29的p56蛋白)进一步抑制E. coli UDG的酶活性。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.参考下表设置PCR反应体系,或者参考所使用的PCR扩增体系设置PCR体系,并加入E. coli UDG酶至终浓度为0.01U/μl。通常仅加入PCR buffer即可,无需加入UDG的buffer。
Reagent Volume Volume Final Concentration
Nuclease-Free Water (18.325-x)μl (36.65-y)μl -
10X PCR Buffer (with Mg2+) 2.5μl 5μl 1X (1.5mM Mg2+)
dNTP/dUTP (2.5mM each/5mM) 2μl 4μl 0.2mM each/0.4mM
Primer mix (10μM each) 2μl 4μl 0.8μM
Template xμl yμl 10pg-1μg
Taq DNA Polymerase (5U/μl) 0.125μl 0.25μl -
E. coli UDG (5U/µl) 0.05μl 0.1μl -
Total volume 25μl  50μl -
注1:根据实验需要,dNTP/dUTP (可购买碧云天D7376 dNTP/dUTP Mixture (2.5mM each/5mM))的终浓度可在0.2-0.6mM之间调整。镁离子的最终终浓度可在1.0-4.0mM之间调整。
注2:对于25μl的PCR反应体系,E. coli UDG (5U/µl)的使用量一般为0.25-0.5U。
注3:模板和引物的用量请参考碧云天Taq DNA Polymerase (D7205/D7207/D7209)使用说明或相应的PCR体系的产品说明书。
2.参考上述反应体系,加入E. coli UDG后混匀,37℃孵育10min (本步骤可以有效去除可能的之前含dUTP的PCR扩增产物的污染),后续就可以立即进入PCR扩增程序(须确保退火温度不低于55℃)。根据我们的实际测试结果发现,在退火温度不低于55℃的情况下,使用本产品的情况下不会影响PCR扩增的产物量。
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