碧云天研发生产的大肠杆菌DNA残留探针法qPCR检测试剂盒，即E.coli DNA Residue Probe qPCR Kit，又称大肠杆菌基因组DNA残留探针法qPCR检测试剂盒(E.coli genomic DNA Residue Probe qPCR Kit)或大肠杆菌宿主细胞基因组DNA残留检测试剂盒，是一种通过探针法qPCR (Quantitative PCR)快速、有效、高灵敏地定量检测各种生物制品样品品中E.coli宿主细胞残留基因组DNA含量的试剂盒。本产品为防污染型，含有优化比例的高品质UDG酶和dUTP，可有效消除PCR扩增过程中带来的产物污染问题造成的假阳性或CT值偏低。

大肠杆菌(E.coli)常用于大规模表达和生产目标蛋白或生物活性分子，包括重组蛋白、疫苗以及抗癌药物等新型医用生物制品[1]。这些生物制品在生产过程中，会有少量大肠杆菌细胞DNA片段的残留。这些片段可能具有免疫原性、感染性或者致瘤性，当其残留水平过高时就可能引发免疫反应、致病性感染以及诱发肿瘤等安全问题[2]。在许多国家和地区，药物注册和监管机构对生物制药产品中的宿主细胞DNA残留有严格的要求和限制。通过检测和控制宿主细胞DNA残留，可以评估生物制品的免疫原性风险和安全性。另外用于微量样品高通量测序时，也需要确保相关的大肠杆菌重组表达的酶没有大肠杆菌DNA的污染。

本试剂盒能高效灵敏地检测E.coli宿主细胞的残留DNA，最低检测限可至飞克(Femtogram, fg)。根据《中华人民共和国药典》2020年版第三部规定，检测DNA残留量的方法包括DNA探针杂交法、荧光染色法和定量PCR法，并且规定以细胞基质生产的生物制剂DNA残留量不能超过100pg/剂，以细菌或真菌基质生产的疫苗DNA残留量不能超过10ng/剂。本试剂盒基于中华人民共和国药典(2020年版)中外源性DNA残留量测定法中的定量PCR法，采用探针法qPCR，检测下限为3fg/μl，检测范围为3fg/μl-300pg/μl。用于阳性对照检测的平均CT值、平均lgCT以及根据标准曲线计算所得的浓度见下表，扩增及标准曲线参考图1。

图1.碧云天大肠杆菌DNA残留探针法qPCR检测试剂盒(D7701)用于不同浓度梯度的阳性对照的扩增曲线及标准曲线。将本试剂盒中的E.coli DNA Control稀释至浓度分别为300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl和3fg/μl，然后用本试剂盒进行qPCR检测。NTC, No Template Control。实测数据可能会因样品、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒特异性强，HeLa细胞和CHO细胞基因组DNA对E.coli DNA残留检测无干扰。本试剂盒只检测E.coli宿主细胞DNA，与其它物种DNA无交叉反应(图2)。

图2.碧云天大肠杆菌DNA残留探针法qPCR检测试剂盒(D7701)检测不同浓度梯度阳性对照以及分别加入10倍量HeLa和CHO细胞基因组DNA的阳性对照的标准曲线。实测数据可能会因样品、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒稳定性高，不同程度的碎片化DNA对E.coli DNA残留检测基本无干扰。利用不同量微球菌核酸酶(Micrococcal Nuclease, MNase) (D7201)将E.coli DNA Control碎片化至不同程度，然后使用本试剂盒进行qPCR检测。结果显示，超过200bp的DNA，基本都会被检测到，不影响检测效果；但如果碎片化程度过于严重，导致200bp以下的DNA居多，会使DNA残留量检测值偏小。本试剂盒检测不同碎片化程度DNA的扩增曲线及标准曲线参考图3，DNA碎片化处理的电泳结果参考图4。

图3.碧云天大肠杆菌DNA残留探针法qPCR检测试剂盒(D7701)对不同程度碎片化大肠杆菌DNA的检测效果图。E.coli基因组DNA经不同量MNase碎片化处理后稀释成如图1中的各个浓度进行检测。实验结果显示，在0.05和0.1 gel unit的MNase处理后，检测结果和未碎片化处理的对照(control)基本一致；在0.5 gel unit的MNase处理后，由于大部分DNA在200bp以下(见图4)，此时CT值明显增加。实测数据可能会因样品、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

图4.不同量MNase碎片化处理的大肠杆菌基因组DNA的电泳图。E.coli DNA约0.5μg，37℃ 15分钟进行碎片化处理后终止反应。实测效果可能会因样品种类、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒重复性好，重复12次检测3pg/μl、30fg/μl E.coli DNA的CT值见下表，CV值(变异系数)均小于5%。

本试剂盒可搭配BeyoMag™磁珠法残留DNA样品制备试剂盒(D0051)用于样品提取，使用E.coli DNA Control模拟样品的回收率测试结果见下表。

注1：回收率和样品浓度、体积、样品种类及实验操作等的不同而存在差异，表中数据仅供参考。

注2：根据中华人民共和国药典(2020年版‧三部)“外源性DNA残留测定法”中“第三法 定量PCR”对于结果计算的要求，加标样品的回收率应在50%~150%之间。

本试剂盒提供了qPCR实验所需的预混液BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X, UDG)和特异性引物探针混合物。预混液包含了高质量、无E.coli DNA残留的BeyoFast™ Taq DNA Polymerase、UDG酶、PCR Buffer、dNTPs、dUTP、稳定剂和镁离子等所有的通用组分；高纯度引物探针混合物以E.coli 23S rDNA的保守区序列作为靶点所设计，二者结合可用于E.coli DNA的超高灵敏度定量检测。此外，本试剂盒提供E.coli DNA Control，作为阳性对照，用于检测试剂盒本身是否能正常工作及构建标准曲线。

本产品提供了Low ROX和High ROX，广泛兼容于无需ROX和需要Low ROX或High ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪。ROX的作用是用于校正与PCR无关的荧光波动，从而最大限度减少孔间差异。这种差异可能由多种因素引起，如移液误差及样品蒸发等。不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同，请根据实际所用仪器选择含高浓度ROX (High ROX)、低浓度ROX (Low ROX)或不含ROX的BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X)。通常含高浓度ROX的BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X, High ROX)也可以用于不需要ROX或需要低浓度ROX的荧光定量PCR仪。常用仪器所需ROX类型请参考如下表格。

本试剂盒如果用于常规的96孔板qPCR检测(建议反应体系为20µl)或384孔板qPCR检测(建议反应体系为10µl)，本产品小包装分别可以进行50次和100次检测，中包装分别可进行200次和400次检测。

-20ºC保存，一年有效。其中Primer/Probe Mix (10X)、Low ROX (50X)、High ROX (50X)须避光保存，并尽量避免反复冻融。

本产品请在首次开启后建议立即使用完毕，或务必在无菌条件下对其适当分装并保存于-20℃，以免空气中的大肠杆菌污染影响实验结果。

使用前请务必确保试剂完全融化，充分混匀后使用。混匀过程尽量避免产生气泡。

Primer/Probe Mix (10X)、Low ROX (50X)、High ROX (50X)中含有荧光染料，保存本产品或设置PCR反应体系时应避免强光照射，以尽量避免荧光淬灭问题。

经测试，本产品反复冻融10次对使用效果无显著影响，但仍需尽量避免反复冻融。反复冻融可能使产品性能下降。

qPCR检测是超高灵敏度的检测，请尽量在标准的PCR实验室中进行检测。PCR反应设置区域须尽量避免各种可能的扩增产物的污染。虽然本产品为防污染型，但仍建议勿在PCR反应设置区域撕开PCR封板膜或打开PCR管盖，PCR产物宜密封后按扩增后产物要求处理，以避免超高浓度的PCR产物污染实验环境。

建议使用带滤芯的吸头配制PCR体系，这样可以最大限度的避免污染导致的假阳性。推荐BeyoGold™无菌滤芯盒装吸头(FTIP631/FTIP635/FTIP638)。

建议使用低吸附的1.5ml离心管，样品回收率高。推荐BeyoGold™ 1.5毫升离心管(无色, 低吸附, Nuclease free) (FTUB312)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。