中文 | English
订货电话
400-1683301
800-8283301
电话订货时间:
工作日9:00-17:00
订货邮件
order@beyotime.com
订货QQ
4001683301
微信在线咨询
订单下载
碧云天订单.xls
核酸相关> 反转录与PCR> 定量PCR
大肠杆菌DNA残留探针法qPCR检测试剂盒
产品编号: D7701S
产品包装:50次
选择包装
价格: ¥ 628.00
产品简介
使用说明
产品文件
相关产品
相关论文
产品问答
产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D7701S 大肠杆菌DNA残留探针法qPCR检测试剂盒 50次 628.00元
D7701M 大肠杆菌DNA残留探针法qPCR检测试剂盒 200次 1858.00元

碧云天研发生产的大肠杆菌DNA残留探针法qPCR检测试剂盒,即E.coli DNA Residue Probe qPCR Kit,又称大肠杆菌基因组DNA残留探针法qPCR检测试剂盒(E.coli genomic DNA Residue Probe qPCR Kit)或大肠杆菌宿主细胞基因组DNA残留检测试剂盒,是一种通过探针法qPCR (Quantitative PCR)快速、有效、高灵敏地定量检测各种生物制品样品品中E.coli宿主细胞残留基因组DNA含量的试剂盒。本产品为防污染型,含有优化比例的高品质UDG酶和dUTP,可有效消除PCR扩增过程中带来的产物污染问题造成的假阳性或CT值偏低。

大肠杆菌(E.coli)常用于大规模表达和生产目标蛋白或生物活性分子,包括重组蛋白、疫苗以及抗癌药物等新型医用生物制品[1]。这些生物制品在生产过程中,会有少量大肠杆菌细胞DNA片段的残留。这些片段可能具有免疫原性、感染性或者致瘤性,当其残留水平过高时就可能引发免疫反应、致病性感染以及诱发肿瘤等安全问题[2]。在许多国家和地区,药物注册和监管机构对生物制药产品中的宿主细胞DNA残留有严格的要求和限制。通过检测和控制宿主细胞DNA残留,可以评估生物制品的免疫原性风险和安全性。另外用于微量样品高通量测序时,也需要确保相关的大肠杆菌重组表达的酶没有大肠杆菌DNA的污染。

本试剂盒能高效灵敏地检测E.coli宿主细胞的残留DNA,最低检测限可至飞克(Femtogram, fg)。根据《中华人民共和国药典》2020年版第三部规定,检测DNA残留量的方法包括DNA探针杂交法、荧光染色法和定量PCR法,并且规定以细胞基质生产的生物制剂DNA残留量不能超过100pg/剂,以细菌或真菌基质生产的疫苗DNA残留量不能超过10ng/剂。本试剂盒基于中华人民共和国药典(2020年版)中外源性DNA残留量测定法中的定量PCR法,采用探针法qPCR,检测下限为3fg/μl,检测范围为3fg/μl-300pg/μl。用于阳性对照检测的平均CT值、平均lgCT以及根据标准曲线计算所得的浓度见下表,扩增及标准曲线参考图1。

Target 300pg/μl 30pg/μl 3pg/μl 300fg/μl 30fg/μl 3fg/μl NTC
平均CT值 18.99 21.95 25.28 29.08 31.9 35.2 Undetermined
平均lgCT 2.37 1.47 0.45 -0.71 -1.57 -2.57 -
浓度 236.5pg/μl 29.55pg/μl 2.85pg/μl 197.14fg/μl 27.18fg/μl 2.67fg/μl -

图1.碧云天大肠杆菌DNA残留探针法qPCR检测试剂盒(D7701)用于不同浓度梯度的阳性对照的扩增曲线及标准曲线。将本试剂盒中的E.coli DNA Control稀释至浓度分别为300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl和3fg/μl,然后用本试剂盒进行qPCR检测。NTC, No Template Control。实测数据可能会因样品、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本试剂盒特异性强,HeLa细胞和CHO细胞基因组DNA对E.coli DNA残留检测无干扰。本试剂盒只检测E.coli宿主细胞DNA,与其它物种DNA无交叉反应(图2)。

图2.碧云天大肠杆菌DNA残留探针法qPCR检测试剂盒(D7701)检测不同浓度梯度阳性对照以及分别加入10倍量HeLa和CHO细胞基因组DNA的阳性对照的标准曲线。实测数据可能会因样品、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本试剂盒稳定性高,不同程度的碎片化DNA对E.coli DNA残留检测基本无干扰。利用不同量微球菌核酸酶(Micrococcal Nuclease, MNase) (D7201)将E.coli DNA Control碎片化至不同程度,然后使用本试剂盒进行qPCR检测。结果显示,超过200bp的DNA,基本都会被检测到,不影响检测效果;但如果碎片化程度过于严重,导致200bp以下的DNA居多,会使DNA残留量检测值偏小。本试剂盒检测不同碎片化程度DNA的扩增曲线及标准曲线参考图3,DNA碎片化处理的电泳结果参考图4。

图3.碧云天大肠杆菌DNA残留探针法qPCR检测试剂盒(D7701)对不同程度碎片化大肠杆菌DNA的检测效果图。E.coli基因组DNA经不同量MNase碎片化处理后稀释成如图1中的各个浓度进行检测。实验结果显示,在0.05和0.1 gel unit的MNase处理后,检测结果和未碎片化处理的对照(control)基本一致;在0.5 gel unit的MNase处理后,由于大部分DNA在200bp以下(见图4),此时CT值明显增加。实测数据可能会因样品、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

图4.不同量MNase碎片化处理的大肠杆菌基因组DNA的电泳图。E.coli DNA约0.5μg,37℃ 15分钟进行碎片化处理后终止反应。实测效果可能会因样品种类、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

本试剂盒重复性好,重复12次检测3pg/μl、30fg/μl E.coli DNA的CT值见下表,CV值(变异系数)均小于5%。

重复次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 CV
3pg/μl CT值 24.41 24.22 24.67 24.79 24.76 25.07 24.71 24.6 25.02 24.86 24.89 25.28 1.11%
30fg/μl CT值 31.54 31.48 30.79 32.2 31.73 30.71 31.99 31.49 31.48 32.1 31.53 31.73 1.38%

本试剂盒可搭配BeyoMag™磁珠法残留DNA样品制备试剂盒(D0051)用于样品提取,使用E.coli DNA Control模拟样品的回收率测试结果见下表。

回收前残留DNA浓度 回收前体积 回收后残留DNA浓度 回收后体积 回收率
30fg/μl 100μl 32.55fg/μl 100μl 108.5%
3fg/μl 100μl 3.08fg/μl 100μl 102.7%

注1:回收率和样品浓度、体积、样品种类及实验操作等的不同而存在差异,表中数据仅供参考。

注2:根据中华人民共和国药典(2020年版‧三部)“外源性DNA残留测定法”中“第三法 定量PCR”对于结果计算的要求,加标样品的回收率应在50%~150%之间。

本试剂盒提供了qPCR实验所需的预混液BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X, UDG)和特异性引物探针混合物。预混液包含了高质量、无E.coli DNA残留的BeyoFast™ Taq DNA Polymerase、UDG酶、PCR Buffer、dNTPs、dUTP、稳定剂和镁离子等所有的通用组分;高纯度引物探针混合物以E.coli 23S rDNA的保守区序列作为靶点所设计,二者结合可用于E.coli DNA的超高灵敏度定量检测。此外,本试剂盒提供E.coli DNA Control,作为阳性对照,用于检测试剂盒本身是否能正常工作及构建标准曲线。

本产品提供了Low ROX和High ROX,广泛兼容于无需ROX和需要Low ROX或High ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪。ROX的作用是用于校正与PCR无关的荧光波动,从而最大限度减少孔间差异。这种差异可能由多种因素引起,如移液误差及样品蒸发等。不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同,请根据实际所用仪器选择含高浓度ROX (High ROX)、低浓度ROX (Low ROX)或不含ROX的BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X)。通常含高浓度ROX的BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X, High ROX)也可以用于不需要ROX或需要低浓度ROX的荧光定量PCR仪。常用仪器所需ROX类型请参考如下表格。

添加ROX类型 适用PCR仪
不需添加 Bio-Rad: CFX384, CFX96, MiniOpticon, iCycler IQ, MyiQ and iQ5;
Eppendorf: Mastercycler ep realplex and realplex2 s;
Qiagen/Corbett Rotor-Gene: 6000;
Roche LightCycler 480; Cepheid SmartCycler; Illumina Eco qPCR
Low ROX ABI: 7500(Fast), ViiA 7, QuantStudio 6 and 7 Flex Systems;
Stratagene: Mx3000P, Mx3005P and Mx4000;
Qiagen/Corbett Rotor-Gene: 3000;
Bio-Rad/MJ: Chromo4, Opticon 2 and Opticon
High ROX ABI GeneAmp 5700; ABI PRISM 7000, 7700; ABI 7300, 7900HT(Fast); ABI StepOne (Plus)

本试剂盒如果用于常规的96孔板qPCR检测(建议反应体系为20µl)或384孔板qPCR检测(建议反应体系为10µl),本产品小包装分别可以进行50次和100次检测,中包装分别可进行200次和400次检测。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
D7701S-1 BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X, UDG) 500μl
D7701S-2 Primer/Probe Mix (10X) 100μl
D7701S-3 Ultrapure Water 500μl
D7701S-4 Dilution Buffer 3ml
D7701S-5 E.coli DNA Control (30ng/μl) 50μl
D7701S-6 Low ROX (50X) 20μl
D7701S-7 High ROX (50X) 20μl
- 说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
D7701M-1 BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X, UDG) 2ml
D7701M-2 Primer/Probe Mix (10X) 400μl
D7701M-3 Ultrapure Water 2ml
D7701M-4 Dilution Buffer 12ml
D7701M-5 E.coli DNA Control (30ng/μl) 200μl
D7701M-6 Low ROX (50X) 80μl
D7701M-7 High ROX (50X) 80μl
- 说明书 1份
保存条件:

-20ºC保存,一年有效。其中Primer/Probe Mix (10X)、Low ROX (50X)、High ROX (50X)须避光保存,并尽量避免反复冻融。

注意事项:

本产品请在首次开启后建议立即使用完毕,或务必在无菌条件下对其适当分装并保存于-20℃,以免空气中的大肠杆菌污染影响实验结果。

使用前请务必确保试剂完全融化,充分混匀后使用。混匀过程尽量避免产生气泡。

Primer/Probe Mix (10X)、Low ROX (50X)、High ROX (50X)中含有荧光染料,保存本产品或设置PCR反应体系时应避免强光照射,以尽量避免荧光淬灭问题。

经测试,本产品反复冻融10次对使用效果无显著影响,但仍需尽量避免反复冻融。反复冻融可能使产品性能下降。

qPCR检测是超高灵敏度的检测,请尽量在标准的PCR实验室中进行检测。PCR反应设置区域须尽量避免各种可能的扩增产物的污染。虽然本产品为防污染型,但仍建议勿在PCR反应设置区域撕开PCR封板膜或打开PCR管盖,PCR产物宜密封后按扩增后产物要求处理,以避免超高浓度的PCR产物污染实验环境。

建议使用带滤芯的吸头配制PCR体系,这样可以最大限度的避免污染导致的假阳性。推荐BeyoGold™无菌滤芯盒装吸头(FTIP631/FTIP635/FTIP638)。

建议使用低吸附的1.5ml离心管,样品回收率高。推荐BeyoGold™ 1.5毫升离心管(无色, 低吸附, Nuclease free) (FTUB312)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.需要用户自备的耗材、仪器和试剂。
a.具有FAM荧光通道的荧光定量PCR仪。
b.DNase-free、RNase-free的吸头、低吸附离心管、荧光定量PCR用96孔板或384孔板、PCR板封板膜。
2.样品准备。
选择合适的残留DNA样品制备试剂盒用于纯化提取生物制品的中间品、半成品和成品等中的大肠杆菌宿主细胞残留的基因组DNA,以此去除样品中抑制qPCR反应的物质。推荐使用BeyoMag™磁珠法残留DNA样品制备试剂盒(D0051)用于样品提取。
注:由于本试剂盒灵敏度特别高,通常建议把样品制备的房间、qPCR反应体系配制的房间、处理扩增产物的房间按顺序分成3个房间,以避免出现假阳性。高浓度E.coli DNA Control处理时须特别小心,仅稀释后的E.coli DNA Control可以带入qPCR反应体系配制的房间。
3.E.coli DNA Control标准曲线设置。
用本试剂盒中提供的Dilution Buffer将E.coli DNA Control (30ng/μl)进行梯度稀释,按照下表依次配制300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl、3fg/μl的E.coli DNA Control。
Tube Number Dilution Methods Concentration
ST0 10μl E.coli DNA Control (30ng/μl) + 90μl Dilution Buffer 3ng/μl
ST1 10μl ST0 + 90μl Dilution Buffer 300pg/μl
ST2 10μl ST1 + 90μl Dilution Buffer 30pg/μl
ST3 10μl ST2 + 90μl Dilution Buffer 3pg/μl
ST4 10μl ST3 + 90μl Dilution Buffer 300fg/μl
ST5 10μl ST4 + 90μl Dilution Buffer 30fg/μl
ST6 10μl ST5 + 90μl Dilution Buffer 3fg/μl
注1:E.coli DNA Control (30ng/μl)和Dilution Buffer使用前置于冰上或4ºC融化,Vortex充分混匀后使用。
注2:每次稀释时应注意充分混匀。
注3:ST0管可置于-20ºC保存,3个月有效;Dilution Buffer可置于4ºC保存,至少一周有效,如果长时间不用,可以在-20ºC保存。
4.样品加标回收质控ERC和阴性质控NEC的制备(选做)。
根据实验需要,设置ERC (Extraction/Recovery Control),即在待测样品中加入已知浓度的标准品,与待测样品同时进行DNA提取,并进行qPCR检测,以计算待测样品的回收率,进而评估样品回收的效率。设置NEC (Negative Extraction Control),即仅含Dilution Buffer不含待测样品,与待测样品同时进行DNA提取,以评估检测系统本身、环境、人为等因素造成的误差及差异等。
a.ERC的制备:以制备加3pg E.coli DNA量的ERC为例,取90μl待测样品和10μl 300fg/μl (即3pg)的ST4加入1.5ml离心管中,充分混匀,标记为ERC。
b.NEC的制备:取100μl Dilution Buffer加入1.5ml离心管中,标记为NEC。
注:ERC、NEC与待测样品须同批进行提取处理(同步骤2)。若样品中E.coli DNA残留较高,需要稀释后再添加E.coli DNA标准品,加标量在样品量的0.1-10倍范围内比较合适。
5.qPCR反应体系的设置。
a.融解并混匀反应所需的各种溶液,置于冰浴上或冰盒内。
b.参考下表在室温或冰浴上设置qPCR反应体系(以96孔板,每孔反应体系为20µl为例)。下表中的Template为样品(纯化提取的或稀释后的)、无模板阴性对照(No Template Control, NTC)、标准品(E.coli DNA Control)、ERC或NEC (可选)。NTC可使用Dilution Buffer。建议每次检测都设置NTC和Standard。
Reagent Volume
BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X, UDG) 10μl
Primer/Probe Mix (10X) 2μl
Template 2μl
Without or Low/High ROX (50X) 0 or 0.4μl
Ultrapure Water To 20μl
c.用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀,室温离心数秒,使液体积聚于管底。
d.将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上,开始PCR反应。
e.荧光检测通道的选择:E.coli DNA Probe的荧光基团是FAM,可选择检测通道为FAM,淬灭基团是BHQ1,如果没有BHQ1,则选择无。
6.qPCR反应程序。
本试剂盒建议采用如下的qPCR程序,本程序是以QuantStudio™ 6 Flex Systems荧光定量PCR仪为例:
a.UDG酶处理:50ºC 5min
b.预变性:95ºC 2min
c.变性:95ºC 15sec
d.退火/延伸:60ºC 30sec
e.重复步骤c和步骤d,总共40个循环
f.最后使用荧光定量PCR仪提供的软件分析检测结果
7.结果的定性判断。
a.无模板阴性对照(NTC):FAM通道无典型扩增曲线,检测结果应为Undetermined或CT值≥38,或根据实验室自身验证结果设定具体标准;
b.标准曲线:R2≥0.98,扩增效率(Efficiency, Eff) = 90-110%;
c.NEC的CT值大于标准曲线最低浓度的CT值;
d.样品浓度的计算:根据标准曲线有效范围内的CT值并结合标准曲线公式计算样品浓度(pg/μl或fg/μl)。请勿使用标准曲线有效范围之外的CT值计算待测样本的浓度;
e.加样回收率的计算:根据待测样品和加标样品(ERC)的检测结果计算加样回收率,加样回收率要求在50-150%之间。计算示例如步骤7f。
f.计算示例:
(a)样品浓度计算示例:
使用碧云天BeyoMag™磁珠法残留DNA样品制备试剂盒(D0051)对100μl模拟待测样品(含BSA)以及对应的加标样品(即在待测样品基础上再添加一定量的标准品)进行制备操作,并使用碧云天大肠杆菌DNA残留探针法qPCR检测试剂盒(D7701)检测样品浓度:
复孔 待测样品CT值 待测样品lgCT 待测样品浓度 加标样品CT值 加标样品lgCT 加标样品浓度
1 33.53 0.97 9.36fg/μl 31.6 1.54 35.0fg/μl
2 34.30 0.74 5.53fg/μl 31.84 1.47 29.7fg/μl
3 33.82 0.89 7.68fg/μl 31.73 1.51 32.0fg/μl
注:上表中用于计算样品浓度的标准曲线公式为:Y = -3.371X + 36.804,其中Y为CT值,X为该待测样品浓度的对数,斜率和Y轴截距是由荧光定量PCR仪自动生成。
(b)加样回收率计算示例:
根据步骤(a)中待测样品浓度及加标样品浓度,计算回收率:
复孔 待测样品浓度 加标样品浓度 洗脱体积 加标量 回收率
1 9.36fg/μl 35.0fg/μl 100μl 3000fg 85.4%
2 5.53fg/μl 29.7fg/μl 100μl 3000fg 80.5%
3 7.68fg/μl 32.0fg/μl 100μl 3000fg 81.1%
注:上表中用于计算加样回收率的公式为:(加标样品的浓度 - 待测样品的浓度) × 洗脱体积 / 加标量。
参考文献:
1.Lee DH, Bae JE, Lee JH, Shin JS, Kim IS. J Microbiol Biotechnol. 2010. 20(10):1463-70.
2.Li D, Zhang Q, Liu G, Zhang L, Gu Z, et al. J Pharm Biomed Anal. 2021. 198:114000.
相关产品:
产品编号 产品名称 包装
D0051S BeyoMag™磁珠法残留DNA样品制备试剂盒 50次
D0051M BeyoMag™磁珠法残留DNA样品制备试剂盒 200次
D7580S 猫细小病毒(FPV)染料法qPCR检测试剂盒 50次
D7580M 猫细小病毒(FPV)染料法qPCR检测试剂盒 200次
D7583S 猫细小病毒(FPV)探针法qPCR检测试剂盒 50次
D7583M 猫细小病毒(FPV)探针法qPCR检测试剂盒 200次
D7589S 猫细小病毒(FPV)等温扩增荧光检测试剂盒 25次
D7589M 猫细小病毒(FPV)等温扩增荧光检测试剂盒 100次
D7701S 大肠杆菌DNA残留探针法qPCR检测试剂盒 50次
D7701M 大肠杆菌DNA残留探针法qPCR检测试剂盒 200次
FASA011-1pc BeyoGold™封板膜刮板 1个/袋
FSF002 荧光定量PCR用封板膜(ABI分装) 20片/包装
FSF035-20pcs BeyoGold™荧光定量PCR用封板膜(压敏型) 20片/包装
FSF035-100pcs BeyoGold™荧光定量PCR用封板膜(压敏型) 100片/包装
FSF039-20pcs BeyoGold™荧光定量PCR用封板膜(压敏型, 进口分装) 20片/包装
FSF039-100pcs BeyoGold™荧光定量PCR用封板膜(压敏型, 进口分装) 100片/包装
FTIP631-10bxs BeyoGold™无菌滤芯盒装吸头(0.5-10μl, 无色加长, 4.5cm) 96个/盒, 10盒/箱
FTIP631-50bxs BeyoGold™无菌滤芯盒装吸头(0.5-10μl, 无色加长, 4.5cm) 96个/盒, 50盒/箱
FTIP635-10bxs BeyoGold™无菌滤芯盒装吸头(1-200μl, 黄色加长, 5.6cm) 96个/盒, 10盒/箱
FTIP635-50bxs BeyoGold™无菌滤芯盒装吸头(1-200μl, 黄色加长, 5.6cm) 96个/盒, 50盒/箱
FTIP638-10bxs BeyoGold™无菌滤芯盒装吸头(100-1000μl, 蓝色加长, 10.2cm) 96个/盒, 10盒/箱
FTIP638-50bxs BeyoGold™无菌滤芯盒装吸头(100-1000μl, 蓝色加长, 10.2cm) 96个/盒, 50盒/箱
FTUB333 荧光定量PCR用96孔板(ABI原装) 20个/包装
FTUB335-10pcs BeyoGold™荧光定量PCR用96孔板(0.2ml, 无裙边, 透明) 10个/盒
FTUB335-50pcs BeyoGold™荧光定量PCR用96孔板(0.2ml, 无裙边, 透明) 10个/盒, 5盒/箱
FTUB337-10pcs BeyoGold™荧光定量PCR用96孔板(0.2ml, 半裙边, 透明) 10个/盒
FTUB337-50pcs BeyoGold™荧光定量PCR用96孔板(0.2ml, 半裙边, 透明) 10个/盒, 5盒/箱
FTUB339-10pcs BeyoGold™荧光定量PCR用96孔板(0.2ml, 高裙边, 磨砂) 10个/盒
FTUB339-50pcs BeyoGold™荧光定量PCR用96孔板(0.2ml, 高裙边, 磨砂) 10个/盒, 5盒/箱
FTUB384 荧光定量PCR用384孔板(ABI分装) 20个/包装
ST578 RNase A (10mg/ml) 1ml
ST579 RNase A (100mg/ml) 0.5ml
ST873-100ml BeyoPure™ Ultrapure Water (PCR级, Sterile) 100ml
物质安全数据单
输入右侧验证码点击下载:
更换校验码
质检证书
输入批号搜寻COA
搜索
相关产品请点击如下按钮:
使用本产品的文献:
购物车
会员
顶部