碧云天研发生产的CHO DNA残留探针法qPCR检测试剂盒，即CHO DNA Residue Probe qPCR Kit，又称CHO基因组DNA残留探针法qPCR检测试剂盒(CHO Genomic DNA Residue Probe qPCR Kit)或CHO宿主细胞基因组DNA残留检测试剂盒(CHO Host Cell Genomic DNA Residue Detection Kit)，是一种通过探针法qPCR (Quantitative PCR)快速、有效、高灵敏、高特异性地定量检测各种生物制品样品中CHO宿主细胞残留基因组DNA含量的试剂盒。本产品为防污染型，含有优化比例的高品质UDG酶和dUTP，可有效消除PCR扩增过程中带来的产物污染问题造成的假阳性或CT值偏低。

中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞是一种能够表达糖基化修饰及其它翻译后修饰的复杂蛋白的常用细胞株，适应能力强，适合大规模培养和重组蛋白的表达纯化[1]，且相对于哺乳动物来说，染色体数目较少[2]。CHO细胞广泛应用于遗传学、毒性筛选、营养和基因表达研究，是目前工业生产重组蛋白治疗药物最常用的哺乳动物宿主细胞[3]。使用CHO细胞生产的生物制品在生产过程中，即使经过严格的纯化过程，仍然可能会有少量CHO细胞DNA片段的残留。这些残留的DNA片段可能具有生物危害性，当其残留水平过高时可能会导致炎症、致癌性和免疫调节障碍等风险增加[4-5]。在许多国家和地区，药物注册和监管机构对生物制药产品中的宿主细胞DNA残留有严格的要求和限制。通过检测和控制宿主细胞DNA残留，可以评估生物制品的免疫原性风险和安全性。

本试剂盒能高效灵敏地检测CHO宿主细胞的残留DNA，最低检测限可至飞克(Femtogram, fg)。根据《中华人民共和国药典》2020年版第三部规定，检测DNA残留量的方法包括DNA探针杂交法、荧光染色法和定量PCR法，并且规定以细胞基质生产的生物制剂DNA残留量不能超过100pg/剂，以细菌或真菌基质生产的疫苗DNA残留量不能超过10ng/剂。本试剂盒基于中华人民共和国药典(2020年版)中外源性DNA残留量测定法中的定量PCR法，采用探针法qPCR，检测下限为3fg/μl，检测范围为3fg/μl-300pg/μl。用于阳性对照检测的平均CT值、平均lgCT以及根据标准曲线计算所得的浓度见下表，扩增曲线及标准曲线参考图1。

图1. 碧云天CHO DNA残留探针法qPCR检测试剂盒(D7703)用于不同浓度梯度的阳性对照的扩增曲线及标准曲线。将本试剂盒中的CHO DNA Control稀释至浓度分别为300pg/μl、30pg/μl、3pg/μl、300fg/μl、30fg/μl和3fg/μl，然后用本试剂盒进行qPCR检测。NTC, No Template Control。实测数据可能会因样品、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒特异性强，HeLa细胞和E.coli细胞基因组DNA对CHO DNA残留检测无干扰。本试剂盒只检测CHO宿主细胞DNA，与其它物种DNA无交叉反应(图2)。

图2. 碧云天CHO DNA残留探针法qPCR检测试剂盒(D7703)检测不同浓度梯度阳性对照以及分别加入3ng HeLa或E.coli细胞基因组DNA的阳性对照的标准曲线。图中可见额外添加的HeLa或E.coli细胞基因组DNA，对于CHO DNA残留的检测无明细干扰。实测数据可能会因样品、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒稳定性高，不同程度的碎片化DNA对CHO DNA残留检测基本无干扰。利用不同量微球菌核酸酶(Micrococcal Nuclease, MNase) (D7201)将CHO DNA Control碎片化至不同程度，然后使用本试剂盒进行qPCR检测。结果显示，超过200bp的DNA，基本都会被检测到，不影响检测效果；但如果碎片化程度过于严重，导致200bp以下的DNA居多，会使DNA残留量检测值偏小。本试剂盒检测不同碎片化程度DNA的扩增曲线及标准曲线参考图3，DNA碎片化处理的电泳结果参考图4。

图3. 碧云天CHO DNA残留探针法qPCR检测试剂盒(D7703)对不同程度碎片化CHO DNA的检测效果图。CHO基因组DNA经不同量MNase碎片化处理后稀释成如图1中的各个浓度进行检测。实验结果显示，在0.05和0.1 gel unit的MNase处理后，检测结果和未碎片化处理的对照(control)基本一致；在0.5 gel unit的MNase处理后，由于大部分DNA在200bp以下(见图4)，此时CT值明显增加，但在浓度达到30fg/μl时，检测出来的CT值通常仍能达到35以下。实测数据可能会因样品、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

图4. 不同量MNase碎片化处理的CHO基因组DNA的电泳图。CHO基因组DNA约0.5μg，37ºC 15分钟进行碎片化处理后终止反应。实测效果可能会因样品种类、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本试剂盒重复性好，重复12次检测3pg/μl、30fg/μl CHO DNA的CT值见下表，CV值(变异系数)均小于5%。

本试剂盒可搭配BeyoMag™磁珠法残留DNA样品制备试剂盒(D0051)用于样品提取，使用CHO DNA Control模拟样品的回收率测试结果见下表。

注1：回收率和样品浓度、体积、样品种类及实验操作等的不同而存在差异，表中数据仅供参考。

注2：根据中华人民共和国药典(2020年版‧三部)“外源性DNA残留测定法”中“第三法 定量PCR”对于结果计算的要求，加标样品的回收率应在50%~150%之间。

本试剂盒提供了qPCR实验所需的预混液BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X, UDG)和特异性引物探针混合物。预混液包含了高质量、无CHO DNA残留的BeyoFast™ Taq DNA Polymerase和UDG酶、PCR Buffer、dNTPs、dUTP、稳定剂和镁离子等所有的通用组分；高纯度引物探针混合物以CHO基因组中高度特异性序列作为靶点所设计，二者结合可用于CHO DNA的超高灵敏度定量检测。此外，本试剂盒提供CHO DNA Control，作为阳性对照，用于检测试剂盒本身是否能正常工作及构建标准曲线。

本产品提供了Low ROX和High ROX，广泛兼容于无需ROX和需要Low ROX或High ROX作为校正染料的荧光定量PCR仪。ROX的作用是用于校正与PCR无关的荧光波动，从而最大限度减少孔间差异。这种差异可能由多种因素引起，如移液误差及样品蒸发等。不同的荧光定量PCR仪对ROX的要求不同，请根据实际所用仪器选择含高浓度ROX (High ROX)、低浓度ROX (Low ROX)或不含ROX的BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X)。通常含高浓度ROX的BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X, High ROX)也可以用于不需要ROX或需要低浓度ROX的荧光定量PCR仪。常用仪器所需ROX类型请参考如下表格。

本试剂盒如果用于常规的96孔板qPCR检测(建议反应体系为20µl)或384孔板qPCR检测(建议反应体系为10µl)，本产品小包装分别可以进行50次和100次检测，中包装分别可进行200次和400次检测。

-20ºC保存，一年有效。其中Primer/Probe Mix (10X)、Low ROX (50X)、High ROX (50X)须避光保存，并尽量避免反复冻融。

本产品请在首次开启后建议立即使用完毕，或务必在无菌条件下对其适当分装并保存于-20ºC，以免空气中的CHO DNA污染影响实验结果。

使用前请务必确保试剂完全融化，充分混匀后使用。混匀过程尽量避免产生气泡。

Primer/Probe Mix (10X)、Low ROX (50X)、High ROX (50X)中含有荧光染料，保存本产品或设置PCR反应体系时应避免强光照射，以尽量避免荧光淬灭问题。

经测试，本产品反复冻融10次对使用效果无显著影响，但仍需尽量避免反复冻融。反复冻融可能使产品性能下降。

qPCR检测是超高灵敏度的检测，请尽量在标准的PCR实验室中进行检测。PCR反应设置区域须尽量避免各种可能的扩增产物的污染。虽然本产品为防污染型，但仍建议勿在PCR反应设置区域撕开PCR封板膜或打开PCR管盖，PCR产物宜密封后按扩增后产物要求处理，以避免超高浓度的PCR产物污染实验环境。

建议使用带滤芯的吸头配制PCR体系，这样可以最大限度的避免污染导致的假阳性。推荐BeyoGold™无菌滤芯盒装吸头(FTIP631/FTIP635/FTIP638)。

建议使用低吸附的1.5ml离心管，样品回收率高。推荐BeyoGold™ 1.5毫升离心管(无色, 低吸附, Nuclease free) (FTUB312)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。