碧云天研发的血管紧张素转换酶2(ACE2)活性荧光检测试剂盒(ACE2 Activity Fluorometric Assay Kit)，是一种用荧光法快速高灵敏检测血管紧张素转换酶2 (Angiotensin I Converting Enzyme 2 or Angiotensin II Converting Enzyme，简称ACE2)活性的试剂盒。

2019年底由新型冠状病毒引起的肺炎疫情，从2020年初开始在全球大流行，感染病例快速上升，引发全球关注。该病毒被世界卫生组织(WHO)命名为2019-nCoV，被国际病毒分类委员会命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)。由新型冠状病毒导致的疾病，被世界卫生组织命名为2019冠状病毒疾病 (Corona Virus Disease 2019, COVID-19)，通常称为新型冠状病毒肺炎，简称“新冠肺炎”。

ACE2是一种含锌离子的金属羧肽酶(metallocarboxypeptidase)，其结构包括一个信号肽、一个跨膜结构域和一个含有HEXXH锌离子结合结构域的金属蛋白酶活性位点。ACE2是人血管紧张素转换酶(Angiotensin I Converting Enzyme，简称ACE或ACE1)的同源基因，是在肺、心脏、肾脏和肠等组织中高表达的跨膜糖蛋白，是肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)的重要成员。ACE2催化Angiotensin I剪切生成九肽的血管扩张剂Ang 1-9，也可以催化Angiotensin II剪切生成七肽的血管扩张剂Ang 1-7，在调节血压、体液平衡、炎症、细胞增殖、肥大和纤维化的方面具有重要作用。同时，ACE2的组织和细胞的特异性表达提示其在调节心血管和肾脏功能以及生育方面发挥重要作用。此外，ACE2是冠状病毒SARS-CoV、SARS-CoV-2 (2019-nCoV)以及HCoV-NL63的受体。SARS-CoV及SARS-CoV-2通过其Spike蛋白受体结合域(receptor binding domain, RBD)与ACE2的肽酶结构域结合，参与病毒的感染过程。ACE2与SARS-CoV-2 Spike蛋白的亲和力是SARS-CoV Spike蛋白的10-20倍。

ACE2在新冠病毒引起的疾病中，扮演了重要而复杂的角色。一方面，ACE2是新冠病毒进入细胞所识别的受体，在小鼠模型中，ACE2表达水平越高，感染就会越严重，因此ACE2起着帮助新冠病毒感染细胞并得以在细胞内复制的“导火线”作用；另一方面，ACE2有一定的保护作用，如果使ACE2表达水平降低，小鼠的肺部损伤就会急剧恶化。因此，ACE2为预防和治疗新冠肺炎提供了新的研究方向，ACE2蛋白作为新冠病毒感染人体、进入细胞的重要靶点已经越来越受到关注。

血管紧张素转换酶2(ACE2)活性荧光检测试剂盒采用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方法，其检测原理如下。

MCA是荧光供体(Donor)，Dnp是荧光受体(Acceptor)或称为淬灭基团(Quencher)，这两个荧光基团的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般7-10nm)，荧光能量由供体向受体转移，导致供体荧光分子自身的荧光强度衰减。MCA和Dnp被连接到ACE2蛋白酶的底物(Substrate)的两端。当ACE2没有切割底物时，两个基团足够接近，发生荧光共振能量转移，即Dnp可淬灭MCA的荧光而导致检测不到荧光；当该底物被ACE2切割后，多肽的首尾两端分离，两个基团分开，MCA的荧光不再被Dnp淬灭，即可检测到MCA的荧光，这样通过荧光检测就可以非常灵敏地检测ACE2蛋白酶的酶活性。MCA的最大激发波长为325nm，最大发射波长为393nm。

图1. 碧云天血管紧张素转换酶2(ACE2)活性荧光检测试剂盒检测原理图。

本试剂盒检测灵敏度高，线性范围宽，样品用量少。96孔板中通常1-10μl细胞或组织样品足够用于ACE2酶活性检测。

本试剂盒使用灵活，检测速度快，适用范围广。本试剂盒中提供了ACE2酶阳性对照(Positive Control)，便于检测体系的建立。本试剂盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血浆以及肺、肠、肝脏等组织或细胞样品的检测。不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选(high-throughput screening)的自动化操作系统。本试剂盒采用一步法检测，简单快速，全程约0.5-1h即可完成。

本试剂盒提供的Lysis Buffer通用性强，可直接用于裂解细胞或动物组织样品用于检测ACE2酶活性。

本试剂盒内提供了MCA Standard，在0.2-50μM范围内有良好的线性关系。可以通过设置标准曲线，计算出样品中ACE2的活性。

用于96孔板检测时，本试剂盒小包装P0319S可以进行100次检测，中包装P0319M可以进行500次检测。

-20℃保存，一年有效。其中P0319-4 Substrate、P0319-5 MCA Standard (10mM)需避光保存。

Assay Buffer、Substrate和MCA Standard (10mM)需完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。Positive Control (10X)使用时应置于冰上，使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。

如果使用本试剂盒提供的Lysis Buffer制备样品，并且加入的样品量在本试剂盒的推荐范围内，可以确保反应体系的pH值在适宜的范围内。如果使用自行配制的裂解液，请确保加入样品后反应体系的pH值在6.5-7.0之间，或者确保样品的pH值在6.5-7.0之间，否则可能会影响检测结果的信号值和稳定性。

体积较小的试剂首次使用时建议先离心数秒使液体沉降于管底，然后再使用。结冻的试剂必须完全融化并混匀后使用。

尽管经测试本试剂盒中的Positive Control (10X)反复冻融5次对活性基本没影响，为取得良好的检测效果，建议第一次使用时适当分装保存。Positive Control (10X)融解后可能会有少量不溶物，属正常现象。尽量充分溶解后，离心取上清使用即可。

虽然本试剂盒中的ACE2底物有很高的特异性，但仍然有可能有一些蛋白酶可以切割本底物，建议进一步使用ACE2特异性抑制剂MLN-4760 (SF1197)进行验证。

检测时建议使用96孔黑板，推荐选购碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)。

细胞、组织等裂解样品如果置于4℃保存，用于ACE2活性检测时，保存的时间不应超过2天，否则会影响检测结果的准确性。通常细胞、组织等裂解样品宜在-20℃保存，-80℃保存更佳。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。