使用说明：
1.样品的制备：
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g, 5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100μl-200μl的比例加入BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay，适当吹打，冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、Tissue Master™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下匀浆。将匀浆液在4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
2.试剂盒的准备工作：
a.融解BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、ACP Assay Buffer、Stop Solution、MUP Substrate (100X)、4-MU (50mM)、平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.MUP Substrate工作液的配制：按照每个反应80µl的体积配制适量的MUP Substrate工作液。取10μl MUP Substrate (100X)加入990μl ACP Assay Buffer，混匀，即可配制成1ml的MUP Substrate工作液。根据待检测样品的数量，配制适量的MUP Substrate工作液。配制好的MUP Substrate工作液如果置于4ºC或冰浴保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。
3.样品测定：
a.4-MU标准曲线的设置。
取2μl 4-MU (50mM)，加入98μl ACP Assay Buffer，混匀，配制成100μl浓度为1mM的4-MU标准溶液。分别取1mM的4-MU标准溶液0、0.2、0.5、1、2、5、10、20μl加入96孔板的标准品孔中，并用ACP Assay Buffer补足至20μl，此时，标准曲线的各孔4-MU的浓度和物质的量分别为0、10、25、50、100、250、500、1000μM或0、0. 2、0. 5、1、2、5、10、20nmol。
注：初次检测，可以按照以上浓度设置标准曲线。在后续的实验中，可以根据样品中酸性磷酸酶的活性对标准品的浓度范围进行适当调整。
b.阳性对照的设置。
取适量的Positive Control (100X)，用ACP Assay Buffer将其100倍稀释，然后取20μl加入96孔板作为阳性样品。例如取阳性对照(100X) 1μl，加入ACP Assay Buffer 99μl，混匀后取20μl加入96孔板作为阳性样品。
注：由于Positive Control (100X)的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
c.取1-20μl稀释后的样品至96孔板样品孔中，并再加入ACP Assay Buffer补足到20µl，同时设置仅含ACP Assay Buffer的孔为空白对照孔。此处的样品体积记为Sv。
注：为确保数值在标准曲线范围内，建议样品同时设定多个稀释倍数，可以进行预实验确定样品的大致浓度，如果数值不在标准曲线范围内，可调整样品的稀释倍数或者增加样品的量。此处的样品稀释倍数记为n。
d.除4-MU标准曲线外的其余各孔中加入MUP Substrate工作液80μl，4-MU标准曲线各孔加入ACP Assay Buffer 80μl，混匀。
e.37ºC避光孵育20-60分钟，反应时间记录为T。
注：为取得最佳的检测结果，反应时间可以根据待测样品中的酸性磷酸酶活性进行调整，但必须确保读数在标准曲线的范围之内。对于酸性磷酸酶活性较高的样品，反应时间可以设为20或30分钟。对于酸性磷酸酶活性较低的样品，反应时间可以设为45分钟或1小时。
f.各孔中立即加入50μl Stop Solution，混匀。
注：如果孔数较多，可以在低温操作或使用排枪操作以减小各孔间加入Stop Solution的时间差而导致的误差，混匀也宜在培养板振荡器上进行。
g.设置酶标仪激发波长为360nm、发射波长为450nm进行荧光强度检测，记为F。
h.建立4-MU标准曲线，将F代入标准曲线，即可计算出反应时间内样品中酸性磷酸酶催化产生的4-MU的量(记为Sa)。4-MU标准曲线可以参考图2A，在0.005-20nmol范围内有良好的线性关系。ACP活性计算公式如下：
ACP Activity (U/L) = Sa × n / (T × Sv)
注：Sa为步骤3h根据标准曲线确定的4-MU生成量(nmol)；
n为步骤3c样品稀释倍数；
T为步骤3e的反应时间(min)；
Sv为步骤3c中的样品体积(ml)。
酸性磷酸酶的活力定义：一个酶活力单位(Unit, U)在25或37ºC，pH4.8的条件下，1分钟内可以生成1μmol的4-MU。
参考文献：
1.Anand A, Srivastava PK. Appl Biochem Biotechnol. 2012. 167(8):2174-97.
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3.Honig, A, Rieger L, Kapp M, Krockenberger M, Eck M, et al. BMC Cancer. 2006. 6:199.
4.Muniyan S, Chaturvedi NK, Dwyer JG, Lagrange CA, Chaney WG, et al. Int J Mol Sci. 2013. 14(5):10438-64.
5.Scerra G, De Pasquale V, Scarcella M, Caporaso MG, Pavone LM, et al. Open Biol. 2022. 12(10):220155.
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