使用说明：
1.样品的准备：
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟-2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g，5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600/E6607)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
2.试剂盒的准备：
a.融解BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、L-LDH Assay Buffer，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.WST-8显色工作液(WST-8 Working Solution)的配制：按照每个反应50µl的体积配制适量的显色工作液。均匀混合44µl L-LDH Assay Buffer、2µl Substrate、2µl L-Lactate Solution、2µl WST-8，即可配制成50µl WST-8显色工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的WST-8显色工作液。具体配制方法参考下表。配制好的WST-8显色工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	10	20	50
L-LDH Assay Buffer (µl)	44	440	880	2200
Substrate (µl)	2	20	40	100
L-Lactate Solution (µl)	2	20	40	100
WST-8 (µl)	2	20	40	100
WST-8 Working Solution (µl)	50	500	1000	2500

注：NADH和NADPH以及会影响NADH和NADPH水平的物质等的存在会对L-乳酸脱氢酶的检测产生干扰。如果样品含有干扰物质，须同时设置样品的背景对照孔，加入不含L-Lactate Solution的WST-8显色工作液，即配制WST-8显色工作液时2µl L-Lactate Solution用L-LDH Assay Buffer替代。计算时样品孔的读数值需要减去背景对照孔的读数。
3.样品测定：
a.L-乳酸脱氢酶标准曲线的设置。
取7μl L- Lactate Dehydrogenase (2.5U/ml)，加入343μl L-LDH Assay Buffer，混匀，配制成50mU/ml L-乳酸脱氢酶标准溶液。分别取50mU/ml的L-乳酸脱氢酶标准溶液0、0.3、1、3、10、20、30、40、50μl加入96孔板的标准品孔中，并用L-LDH Assay Buffer补足至50μl，此时，标准曲线的浓度分别为0、0.3、1、3、10、20、30、40、50mU/ml。
注：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
b.取1-50μl样品或稀释后的样品至96孔板样品孔中，并加入L-LDH Assay Buffer至样品孔中，补足50µl。同时设置仅含L-LDH Assay Buffer的孔为空白对照。
注：为确保样品数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品设置多个稀释倍数，以确定样品中L-乳酸脱氢酶的大致活性，如果数值不在标准曲线范围内，请调整样品的稀释倍数或者样品的量。样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为25µl，则n=10×50/25=20)。
c.各孔加入WST-8显色工作液50µl，混匀。
d.立即使用适当的酶标仪在450nm测定吸光度。此时记录0分钟读值为A1。
e.37ºC反应20-30分钟，测定A450，记为A2。吸光值的升高取决于L-乳酸脱氢酶的活性，ΔA = A2-A1。
注：为取得最佳的检测结果，反应时间可以根据待测样品中的L-乳酸脱氢酶活性进行调整，但必须确保读数在标准曲线的范围内。对于L-乳酸脱氢酶活性较高的样品，建议测定总时间为20或30分钟，对应的测定间隔时间设为2分钟或5分钟。对于L-乳酸脱氢酶活性较低的样品，可以延长测定总时长为1小时，对应的测定间隔时间设为10或20分钟；也可以连续测定30分钟，每隔1或2分钟测定1次，最后取呈线性的时间点前的数据用于分析或计算。
f.建立L-乳酸脱氢酶标准曲线，将ΔA代入标准曲线，即可计算出反应时间内样品中L-乳酸脱氢酶的活性B。L-乳酸脱氢酶标准曲线可以参考图2A，在0.3-50mU/ml范围内有良好的线性关系。L-LDH活性计算公式如下：
L-LDH Activity (mU/ml) = B × n
注：B为步骤3f中根据标准曲线确定的L-LDH活性(mU/ml)；
n为步骤3b中样品总稀释倍数。
L-乳酸脱氢酶酶活力单位的定义：1个酶活力单位(unit, U)在25或37ºC，pH7.5的条件下，在1分钟内可以催化生成1µmol丙酮酸。
参考文献：
1.Markert CL. Cell Biochem Funct. 1984. 2(3):131-4.
2.Feng Y, Xiong Y, Qiao T, Li X, Jia L, et al. Cancer Med. 2018. 7(12):6124-6136.
3.Cristescu ME, Innes DJ, Stillman JH, Crease TJ. BMC Evol Biol. 2008. 8:268.
4.Forkasiewicz A, Dorociak M, Stach K, Szelachowski P, Tabola R, et al. Cell Mol Biol Lett. 2020. 25:35.
5.Claps G, Faouzi S, Quidville V, Chehade F, Shen S, et al. Nat Rev Clin Oncol. 2022. 19(12):749-762.
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