使用说明：
1.样品的准备：
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟-2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g，5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600/E6607)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
2.试剂盒的准备：
a.融解BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、Total LDH Assay Buffer，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.NADH标准品的配制：4mg NADH中加入524μl Total LDH Assay Buffer，充分溶解，配制成10mM NADH标准品。10mM NADH标准品请适当分装后-80℃避光保存。
c.WST-8显色工作液(WST-8 Working Solution)的配制：按照每个反应50µl的体积配制适量的显色工作液。均匀混合44µl Total LDH Assay Buffer、2µl Substrate、2µl DL-Lactate Solution、2µl WST-8，即可配制成50µl WST-8显色工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的WST-8显色工作液。具体配制方法参考下表。配制好的WST-8显色工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	10	20	50
Total LDH Assay Buffer (µl)	44	440	880	2200
Substrate (µl)	2	20	40	100
DL-Lactate Solution (µl)	2	20	40	100
WST-8 (µl)	2	20	40	100
WST-8 Working Solution (µl)	50	500	1000	2500

注：NADH和NADPH以及会影响NADH和NADPH水平的物质等的存在会对L-乳酸脱氢酶的检测产生干扰。如果样品含有干扰物质，须同时设置样品的背景对照孔，加入不含DL-Lactate Solution的WST-8显色工作液，即配制WST-8显色工作液时2µl DL-Lactate Solution用Total LDH Assay Buffer替代。计算时样品孔的读数值需要减去背景对照孔的读数。
3.样品测定：
a.NADH标准曲线的设置。
取20μl 10mM NADH标准品，加入180μl Total LDH Assay Buffer，混匀，配制成1mM NADH标准溶液。分别取1mM的NADH标准溶液0、0.5、1、2.5、5、10、25、50μl加入96孔板的标准品孔中，并用Total LDH Assay Buffer补足至50μl，此时，标准曲线的浓度和物质的量分别为0、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1mM或0、0.5、1、2.5、5、10、25、50nmol。
b.取1-50μl样品或稀释后的样品至96孔板样品孔中，并加入Total LDH Assay Buffer至样品孔中，补足至50µl。同时设置仅含Total LDH Assay Buffer的孔为空白对照。此处的样品体积记为Sv。
注：为确保样品数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品设置多个稀释倍数，以确定样品中总乳酸脱氢酶的大致活性，如果数值不在标准曲线范围内，请调整样品的稀释倍数或者样品的量。此处的样品稀释倍数记为n。
c.各孔加入WST-8显色工作液50µl，混匀。
d.立即使用适当的酶标仪在450nm测定吸光度。此时记录0分钟读值为A1。
e.37ºC反应20-30分钟，反应时间记录为T，测定A450，记为A2。吸光值的升高取决于总乳酸脱氢酶的活性，ΔA = A2-A1。
注：为取得最佳的检测结果，反应时间可以根据待测样品中的总乳酸脱氢酶活性进行调整，但必须确保读数在标准曲线的范围内。对于总乳酸脱氢酶活性较高的样品，建议测定总时间为20或30分钟，对应的测定间隔时间设为2分钟或5分钟。对于总乳酸脱氢酶活性较低的样品，可以延长测定总时长为1小时，对应的测定间隔时间设为10或20分钟；也可以连续测定30分钟，每隔1或2分钟测定1次，最后取呈线性的时间点前的数据用于分析或计算。
f.建立NADH标准曲线，将ΔA代入标准曲线，即可计算出反应时间内样品中乳酸脱氢酶催化产生的NADH量(记为Sa)。NADH标准曲线可以参考图2A，在0.5-50nmol范围内有良好的线性关系。Total LDH活性计算公式如下：
Total LDH Activity (nmol/min/ml or mU/ml) = Sa × n / (T × Sv)
注：Sa为步骤3f中根据标准曲线确定的NADH生成量(nmol)；
n为步骤3b中样品稀释倍数；
T为步骤3e中的反应时间(min)；
Sv为步骤3b中的样品体积(ml)。
总乳酸脱氢酶酶活力单位的定义：一个酶活力单位(unit, U)在25或37ºC，pH7.5的条件下，在1分钟内可以催化生成1µmol NADH。
示例：
NADH生成量(Sa)＝6nmol；
反应时间(T)＝30min；
样品体积(Sv)＝0.01ml；
样品稀释倍数(n)＝2；
Total LDH Activity＝6×2/(30×0.01)＝40nmol/min/ml，或40mU/ml。
参考文献：
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