使用说明：
对于用NTA-Ni琼脂糖磁珠纯化大肠杆菌中His标签蛋白比较熟悉的使用者可以直接参考“7. 简化的操作流程”。否则请参考如下详细内容：
如下以最常见的大肠杆菌中表达纯化His标签重组蛋白为例，说明本产品的使用方法。在其它体系中表达时，请参考该表达体系的相关使用说明，并借鉴大肠杆菌中纯化His标签重组蛋白的使用说明。
1.大肠杆菌中His标签重组蛋白的诱导表达：
如下以最常用的IPTG诱导表达系统给予说明，诱导表达条件的优化请参照所使用的诱导表达体系的详细说明。其它诱导表达系统请参考适当的使用说明进行。
a.挑取表达His标签重组蛋白的单克隆，接种到3ml或10-20ml含适当抗生素的LB培养液中，培养过夜。
b.按照1:20的比例取培养过夜的菌液，接种到预热至37ºC并含适当抗生素的LB培养液中。例如取5ml培养过夜的菌液接种到100ml预热至37ºC并含适当抗生素的LB培养液中。具体的培养体积视需要纯化的蛋白量而定，初步的鉴定培养3-10ml即可；常规的表达纯化，通常可考虑培养100-200ml；制备型的纯化，培养体积可以达到1L或更大。如果希望取得更好的表达效果，建议按照1:100的比例接种过夜培养的菌液，但后续培养至相应的OD值需要更长的时间。
c.37ºC常规培养约30-60min或更长时间，至菌液的OD600达到0.5-0.7，并且OD600最好接近0.6。
d.加入IPTG至终浓度为1mM，继续培养4-5小时。
注：可以在加入IPTG前取出少量菌液同样培养4-5小时后作为未诱导的对照，也可以在加入IPTG前直接取出少量菌液作为未诱导的对照。对于特定蛋白的诱导表达，最佳的IPTG浓度、诱导温度、和诱导时间需要通过实验确定。
e.收集菌液至离心管中，4ºC 4,000×g离心20min或4ºC 15,000×g离心1min，弃上清，收集沉淀。随后即可进入细菌裂解步骤，也可以在-20ºC或-80ºC冻存备用。冷冻保存的菌体使用前需置于冰上解冻15min。
2.NTA-Ni琼脂糖磁珠的准备：
a.用移液器轻轻吹打重悬NTA-Ni琼脂糖磁珠，按照每5mg目标蛋白(分子量约为60kD)需要使用1ml磁珠悬浊液的用量，取适量NTA-Ni琼脂糖磁珠至一洁净离心管中(FTUB015)，磁性分离去除上清；加入与原磁珠悬浊液等体积的非变性洗涤液洗涤磁珠。
b.用移液器轻轻吹打重悬NTA-Ni琼脂糖磁珠。置于磁力架(FMS012/FMS024)上分离10秒，去除上清。重复上述步骤两次。
注：为了减少磁珠的损耗，待溶液澄清后，盖紧离心管盖子，保持离心管仍在磁力架上，按住离心管上下翻转数次，使澄清的溶液洗涤离心管盖子上残留的磁珠，静置后使溶液变澄清。以下所有的磁性分离都可以参考执行。
c.根据后续纯化时采用非变性还是变性条件，分别选择加入与原磁珠悬浊液等体积的非变性洗涤液或变性洗涤液重悬琼脂糖磁珠，备用。
3.非变性条件下His标签蛋白的小量纯化：
本方法常用于小量样品的快速分析和鉴定，为后续大量制备打下基础。
a.接步骤1(e)，离心收集1ml菌液的细菌沉淀并弃上清，加入100µl非变性裂解液，将细菌沉淀充分重悬于裂解液中，可进行轻微的vortex(尽量避免产生气泡)。
注：根据His标签重组蛋白表达的丰度，菌液和裂解液的体积比可以在25:1-5:1范围内适当调整。表达丰度非常高时，每毫升菌液沉淀可以加入200µl裂解液；表达丰度非常低时，每毫升菌液沉淀可以加入40µl裂解液。相关溶液的配制方法附后。本非变性裂解液可以确保裂解绝大多数可溶性蛋白和包涵体蛋白，裂解后可以直接用于SDS-PAGE。如有必要，可以在裂解细菌之前，在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物，例如碧云天的P1030/P1031 蛋白酶抑制剂混合物(His-Tag蛋白纯化用, 100X)。加入的蛋白酶抑制剂混合物不能对NTA-Ni琼脂糖磁珠的性能有影响。如果自行配制相关缓冲液，EDTA、EGTA等螯合剂和DTT、巯基乙醇等还原剂的浓度不宜超过1mM。
b.加入溶菌酶至1mg/ml并轻轻混匀，尽量避免产生气泡，冰水浴或冰上放置30min。
注：溶菌酶可以用裂解液配制成100mg/ml的母液，临使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20ºC保存。
c.轻轻vortex数下，以充分裂解细菌，尽量避免产生气泡。
d.4ºC离心(15,000×g, 10min)，取10µl上清留样作后续检测用，收集余下上清至一新的洁净离心管中。
e.加入磁珠与孵育。加入20µl步骤2中混合均匀的NTA-Ni琼脂糖磁珠悬浊液，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育20-30min。注：如果需要，可以在2-8ºC旋转混合1小时，以防止目标蛋白降解。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)或BeyoVortex™基础型旋转混匀仪(E6800)。
f.磁分离。孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，去除上清。注：可保留部分上清液，用于检测目的蛋白的结合效果。
g.洗涤。加入100µl非变性洗涤液，用移液器轻轻吹打重悬NTA-Ni琼脂糖磁珠。置于磁力架上分离10秒，取20µl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。共重复洗涤三次。
h.洗脱。加入20µl非变性洗脱液，轻轻翻转离心管数次，使磁珠悬浮孵育5min，磁性分离，收集洗脱液到新的离心管，即为纯化获得的His标签蛋白。如果有必要，可以重复洗脱步骤一次，收集样品到新的离心管中，还可以得到一些His标签蛋白。
4.非变性条件下His标签蛋白的大量纯化：
a.接步骤1(e)，对于新鲜的或解冻的细菌沉淀，按照每克细菌沉淀湿重加入4ml (2-5ml均可)非变性裂解液的比例加入裂解液，充分重悬菌体。如有必要，可以在裂解细菌之前，在裂解液中添加适量的蛋白酶抑制剂混合物，例如碧云天的P1030/P1031蛋白酶抑制剂混合物(His-Tag蛋白纯化用, 100X)。注：后续试剂用量均按照1克菌重和4ml裂解液用量进行。
b.加入溶菌酶至终浓度为1mg/ml并混匀，冰水浴或冰上放置30min。
注：溶菌酶可以用裂解液配制成100mg/ml的母液，临使用前加入。溶菌酶配制成母液后，可以适当分装后-20ºC保存。
c.冰上超声裂解细菌。超声功率200-300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次。
注：具体超声处理的方式须根据特定型号的超声仪器自行摸索和优化。
d.(可选做)如果超声处理后裂解液非常粘稠，可以加入适量核酸酶，如RNase A至10µg/ml及DNase I至5µg/ml，或BeyoZonase™超级核酸酶(≥99%) (D7121)，冰上放置10-30min，以降解核酸。或者也可以使用适当的装好了较细针头的注射器，反复抽吸数次，以剪切粘稠的基因组DNA等。
e.4ºC 10,000×g离心20-30min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上。可以取20µl上清留作后续检测用。
注：上清必须保持澄清，即不含任何不溶物，才能进行下一步的纯化。上清中如果混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度。
f.加入磁珠与孵育。加入1ml步骤2中混合均匀的NTA-Ni琼脂糖磁珠，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育20-30分钟。注：如果需要，可以在2-8ºC旋转混合1小时，以防止目标蛋白降解。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)或BeyoVortex™基础型旋转混匀仪(E6800)。
g.磁分离。孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，去除上清。注：可保留部分上清液，用于检测目的蛋白的结合效果。
h.洗涤。洗涤磁珠5次，每次加入0.5-1ml非变性洗涤液，每次均收集约20µl穿柱的洗涤液用于后续的分析检测用。洗涤及下一步洗脱过程中可以用Bradford法(P0006或P0006C)简单快速地检测每次洗涤液和洗脱液中的蛋白含量，从而考虑增加或减少洗涤和洗脱的次数。
注：如果出现后续获得蛋白纯度不够高的情况，可以再增加洗涤次数2-3次。
i.洗脱。洗脱目的蛋白6-10次，每次用0.5ml非变性洗脱液洗脱。将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中。收集获得的洗脱液即为纯化的His标签蛋白样品。
5.变性条件下His标签蛋白的小量纯化：
本方法常用于小量样品的快速分析和鉴定，为后续大量制备打下基础。
a.接步骤1(e)，离心收集1ml菌液的细菌沉淀并弃上清，加入100μl变性裂解液，将细菌沉淀充分重悬于裂解液中，可进行轻微的vortex(尽量避免产生气泡)。
注：根据His标签重组蛋白表达的丰度，菌液和裂解液的体积比可以在25:1-5:1范围内适当调整。表达丰度非常高时，每毫升菌液沉淀可以加入200μl裂解液；表达丰度非常低时，每毫升菌液沉淀可以加入40μl裂解液。相关溶液的配制方法附后。本变性裂解液可以确保裂解绝大多数可溶性蛋白和包涵体蛋白，含尿素裂解液裂解后可以直接用于SDS-PAGE，含盐酸胍的裂解液裂解后需透析除去盐酸胍才可用于SDS-PAGE。
b.冰上超声裂解细菌。超声功率200-300W，每次超声处理10s，每次间隔10s，共超声处理6次。具体超声处理的方式须根据特定型号的超声仪器自行摸索和优化。
c.4ºC离心(15,000×g, 10min)，取10μl上清留样作后续检测用，收集余下上清至一新的洁净离心管中。
d.加入磁珠与孵育。加入20μl步骤2中混合均匀的NTA-Ni琼脂糖磁珠，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育20-30分钟。注：如果需要，可以在2-8ºC旋转混合1小时，以防止目标蛋白降解。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)或BeyoVortex™基础型旋转混匀仪(E6800)。
e.磁分离。孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，去除上清。注：可保留部分上清液，用于检测目的蛋白的结合效果。
f.洗涤。加入100μl变性洗涤液重悬磁珠，置于磁力架上分离10秒，取20µl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。
g.重复洗涤。加入100μl变性洗涤液重悬磁珠，置于磁力架上分离10秒，取20µl上清留样作后续检测用，其余上清弃去。
h.洗脱。加入20µl变性洗脱液，轻轻翻转离心管数次，使磁珠悬浮孵育5min，磁性分离，收集洗脱液到新的离心管，即为纯化获得的His标签蛋白。如果有必要，可以重复洗脱步骤一次，收集样品到新的离心管中，还可以得到一些His标签蛋白。
6.变性条件下His标签蛋白的大量纯化：
接步骤1(e)，对于新鲜的或解冻的细菌沉淀，按照每1L表达菌加入80ml变性裂解液的比例加入裂解液，充分重悬菌体。
a.冰上超声裂解细菌。超声功率200-300W，每次超声处理2s，每次间隔2s，共超声处理15-30min。
注：具体超声处理的方式须根据特定型号的超声仪器自行摸索和优化。
b.(可选做)如果超声处理后裂解液非常粘稠，可以使用适当的装好了较细针头的注射器，反复抽吸数次，以剪切粘稠的基因组DNA等。
c.4ºC 10,000×g离心20-30min，收集细菌裂解液上清并置于冰水浴或冰上。可以取20μl上清留作后续检测用。
注：上清必须保持澄清，即不含任何不溶物，才能进行下一步的纯化。上清中如果混有不溶性杂质会严重影响后续纯化获得蛋白的纯度。
d.加入磁珠与孵育。按照每0.25ml实体积琼脂糖磁珠凝胶(相当于1ml步骤2中混合均匀的NTA-Ni琼脂糖磁珠悬浊液)中加入4ml细菌裂解液上清的比例(1:16)，混合步骤2中混合均匀的NTA-Ni琼脂糖磁珠和细菌裂解液上清，置于侧摆摇床或旋转混合仪上，室温孵育20-30分钟。注：如果需要，可以在2-8ºC旋转混合1小时，以防止目标蛋白降解。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)或BeyoVortex™基础型旋转混匀仪(E6800)。
e.磁分离。孵育完毕后，置于磁力架上分离10秒，去除上清。注：可保留部分上清液，用于检测纯化的效果。
f.洗涤。洗涤磁珠5次，每次加入0.5-1ml变性裂解液，每次均收集约20µl洗涤液用于后续的分析检测用。洗涤及下一步洗脱过程中可以用Bradford法(P0006或P0006C)简单快速地检测每次洗涤液和洗脱液中的蛋白含量，从而考虑增加或减少洗涤和洗脱的次数。
注：如果出现后续获得蛋白纯度不够高的情况，可以再增加洗涤次数2-3次。
g.重复洗涤。再次洗涤磁珠5次，每次加入0.5-1ml变性洗涤液，每次均收集约20µl穿柱的洗涤液用于后续的分析检测用。
注：如果出现后续获得蛋白纯度不够高的情况，可以再增加洗涤次数2-3次。
h.洗脱。洗脱目的蛋白5-10次，每次用0.5ml变性洗脱液。将每次的洗脱液分别收集到不同的离心管中。收集获得的洗脱液即为纯化获得的His标签蛋白样品。
7.简化的操作流程：
a.细菌中的目的蛋白诱导表达后，离心沉淀细菌。根据待纯化蛋白的溶解性，选择非变性或变性条件进行纯化。
b.每克细菌沉淀湿重加入4ml裂解液，可添加适量蛋白酶抑制剂，充分重悬细菌。
c.冰上超声裂解细菌，离心取上清。非变性条件下可以先使用溶菌酶处理，然后再进行超声处理。
d.用与原磁珠悬浊液等体积的非变性洗涤液平衡NTA-Ni琼脂糖磁珠2次。
e.按照每4ml裂解液使用1ml磁珠悬浊液的比例，取步骤7c中的上清与NTA-Ni琼脂糖磁珠结合。
f.非变性条件下，用0.5-1ml洗涤液洗涤磁珠5次。变性条件下需要先使用0.5-1ml裂解液洗涤5次，然后再使用0.5-1ml洗涤液洗涤磁珠5次。
注：如果出现咪唑浓度偏低的情况，可以自行添加适量咪唑，如果出现咪唑浓度偏高的情况，可以使用试剂盒提供的裂解液作为洗涤液使用。
g.用0.5ml洗脱液洗脱6-10次。
注：通常该洗脱条件会比较理想。如果出现洗脱效果欠佳的情况，可以自行在洗脱液中额外加入250mM的咪唑。
常见问题：
如果纯化不成功，可以对纯化过程中收集的每个组分进行SDS-PAGE电泳检测，分析其原因。
1.蛋白无法与NTA-Ni琼脂糖磁珠结合
a.测序检查基因序列的读码框是否正确。
b.尝试将标签加在蛋白的另一端。
c.增加NTA-Ni琼脂糖磁珠与蛋白结合时间(如4ºC过夜)。
d.检查所有缓冲液和溶液的pH值是否正确。
e.确认体系中所用各种试剂的浓度在NTA-Ni琼脂糖磁珠的耐受范围以内。
f.自行配制裂解液，降低裂解液中的咪唑浓度。
2.目的蛋白被洗涤液洗脱
a.自行配制洗涤液，降低洗涤液中的咪唑浓度或者稍微提高其pH值。
b.检查洗涤液的pH和成分。
c.确认洗涤液中各种试剂的浓度在耐受范围内。
3.蛋白在纯化过程中形成沉淀
a.将纯化温度控制在室温。
b.加入去垢剂，如0.1% Triton X-100或者Tween-20。
4.蛋白无法洗脱
a.用梯度pH及咪唑洗脱，确定最优洗脱条件。
5.目的蛋白与其它蛋白共同洗脱
a.提高裂解液和洗涤液中的咪唑浓度。
b.降低NTA-Ni琼脂糖磁珠的使用量。
c.增加盐或者去垢剂浓度，或者向洗涤液中加入乙醇或甘油以降低非特异相互作用。
d.检查基因内部是否含有起始密码子(C端标记蛋白)或者提前终止位点(N端标记蛋白)。
参考文献：
1.Bromberg R, Cai K, Guo Y, Plymire D, Emde T, et al. Front Mol Biosci. 2022. 9:912072.
2.Zeng K, Sun EJ, Liu ZW, Guo J, Yuan C, et al. RSC Adv. 2020. 10(19):11524-11534.
相关产品：

产品编号	产品名称	包装
P2210	BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐还原螯合型)	10ml
P2218	BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐还原螯合型)	100ml
P2220	BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐还原螯合型)	1000ml
P2221-10ml	BeyoGold™ His-tag Purification Resin (Fast Flow, 耐还原螯合型)	10ml
P2221-100ml	BeyoGold™ His-tag Purification Resin (Fast Flow, 耐还原螯合型)	100ml
P2221-1000ml	BeyoGold™ His-tag Purification Resin (Fast Flow, 耐还原螯合型)	1000ml
P2226	His标签蛋白纯化试剂盒(耐还原螯合型)	10ml
P2229S	His标签蛋白纯化试剂盒(耐变性剂型)	10ml
P2233-10ml	BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)	10ml
P2233-100ml	BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)	100ml
P2233-1000ml	BeyoGold™ His-tag Purification Resin (耐变性剂型)	1000ml
P2236-10ml	BeyoGold™ His-tag Purification Resin (Fast Flow, 耐变性剂型)	10ml
P2236-100ml	BeyoGold™ His-tag Purification Resin (Fast Flow, 耐变性剂型)	100ml
P2236-1000ml	BeyoGold™ His-tag Purification Resin (Fast Flow, 耐变性剂型)	1000ml
P2135-0.5ml	BeyoMag™ Anti-His Magnetic Beads (Anti-His磁珠)	0.5ml
P2135-2ml	BeyoMag™ Anti-His Magnetic Beads (Anti-His磁珠)	2ml
P2239-2ml	BeyoMag™ His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠(IDA-Ni)	2ml
P2239-10ml	BeyoMag™ His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠(IDA-Ni)	10ml
P2239-50ml	BeyoMag™ His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠(IDA-Ni)	50ml
P2241-2ml	BeyoMag™ His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠(NTA-Ni)	2ml
P2241-10ml	BeyoMag™ His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠(NTA-Ni)	10ml
P2241-50ml	BeyoMag™ His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠(NTA-Ni)	50ml
P2243-2ml	BeyoMag™ His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠(TED-Ni)	2ml
P2243-10ml	BeyoMag™ His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠(TED-Ni)	10ml
P2243-50ml	BeyoMag™ His标签蛋白纯化琼脂糖磁珠(TED-Ni)	50ml
P2245S	His标签蛋白纯化试剂盒(IDA-Ni琼脂糖磁珠)	10ml
P2247S	His标签蛋白纯化试剂盒(NTA-Ni琼脂糖磁珠)	10ml
P2249S	His标签蛋白纯化试剂盒(TED-Ni琼脂糖磁珠)	10ml
FMS012	BeyoMag™磁分离架(12孔)	1个/袋
FMS024	BeyoMag™磁分离架(24孔)	1个/袋
FMS096	BeyoMag™磁分离架(96孔)	1个/盒
FMS004	BeyoMag™磁分离架(4孔, 1.5ml/2ml, 蓝)	1个/盒
FMS008	BeyoMag™磁分离架(8孔, 1.5ml/2ml, 蓝)	1个/盒
FMS016	BeyoMag™磁分离架(16孔, 1.5ml/2ml, 蓝)	1个/盒
FMS154	BeyoMag™磁分离架(4孔, 15ml, 蓝)	1个/盒
FMS504	BeyoMag™磁分离架(4孔, 50ml, 蓝)	1个/盒
FMS081	BeyoMag™磁分离架(96孔, PCR板, 蓝)	1个/盒
FMS085	BeyoMag™磁分离架(96孔, 平底板, 蓝)	1个/盒
FMS009	BeyoMag™磁分离架(8孔, 1.5ml/2ml, 铝合金)	1个/盒
FMS015	BeyoMag™磁分离架(16孔, 1.5ml/2ml, 铝合金)	1个/盒
FMS025	BeyoMag™磁分离架(24孔, 1.5ml/2ml, 铝合金)	1个/盒
FMS082	BeyoMag™磁分离架(96孔, PCR板, 铝合金)	1个/盒
FMS086	BeyoMag™磁分离架(96孔, 细胞培养板, 铝合金)	1个/盒