使用说明：
1.实验前准备：
a．需自备水平转子离心机(离心力≥1200×g)。整个梯度离心要求是慢升慢降，需要设置离心机的加速度为1-3，关闭刹车，须自然停止。
b．抗凝剂的选择：若分离出的淋巴细胞直接用于检测，可选用枸橼酸钠抗凝剂；若分离出的淋巴细胞需进一步培养，则选用肝素抗凝剂。
c．血液样品应是新鲜抗凝血，避免冷藏或冷冻。血液样品离体2小时内分离效果最佳；血液样品离体2-4小时，分离效果尚可；血液样品离体4小时以上，分离效果差或无法进行分离操作。
d．为保证最佳分离效果，
整个实验过程要求检测样品、使用试剂、离心及实验室的温度均保持在20±2ºC。
2.血液样品的稀释(选做)：
a.选用不含有钙镁离子缓冲液或生理盐水或培养基对样品进行稀释。推荐选择碧云天生产的PBS (
C0221A)和生理盐水(
ST341)。
b.按照血液样品:PBS或生理盐水=2:1的比例对血液样品进行稀释。
3.淋巴细胞的分离：
a.分离液和血液样品的加入：取一支新的15ml或50ml无菌离心管，先加入一定量分离液；随后将管子小心地倾斜45度，并沿着壁管缓慢地加入血液样品，使样品顺着管壁缓慢滑动到接近分离液液面处，避免血液样品冲入液面下，此时血液样品平铺在分离液的液面上，注意保持两液面界面清晰，切勿搅动液面或摇晃、混匀。
注1：可以使用无菌巴氏吸管(
FPIP002/
FPIP004/
FPIP008)吸取血液样品或后续的血浆层、淋巴细胞。
注2：由于分离液和血液的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多导致加样时间较长，在离心前出现红细胞成团下沉属正常现象。
注:3：如果使用特殊的外周血淋巴细胞分离管如SepMate™ PBMC Isolation Tube等进行分离，请同时参考该离心管的使用说明进行操作。
b.当样品体积小于3ml时，加入3ml分离液，然后按15ml离心管进行操作；当样品体积在3-20ml范围内时，分别按15ml (步骤c)、50ml (步骤d)两种规格的离心管进行操作。
注1：可将血液样品和分离液置于20ºC水浴中孵育20分钟，以保证最佳分离温度。
注2：分离液体积不得少于3ml。
c.对于15ml离心管：
(1) 稀释过的血液样品：推荐最佳比例为5ml分离液+4ml稀释后的血液样品；推荐最佳离心条件为20ºC，500×g，离心25分钟。
(2) 未稀释的血液样品：推荐最佳比例为5ml分离液+5ml血液样品；推荐最佳离心条件为20ºC，600×g，离心25分钟。
d.对于50ml离心管：
(1)稀释过的血液样品：推荐最佳比例为20ml分离液+20ml稀释后的血液样品；推荐最佳离心条件为20ºC，650×g，离心30分钟。
(2)未稀释的血液样品：推荐最佳比例为20ml分离液+20ml血液样品；推荐最佳离心条件为20ºC，600×g，离心30分钟。
e.条件的优化：
(1)根据离心后乳白色环状层(淋巴细胞层)显现状态，调整样品稀释倍数。乳白色环状层弥散，应适当提高样品的稀释倍数；乳白色环状层很浅或没有，应适当降低样品的稀释倍数。
(2)根据离心后淋巴细胞存在的分层位置，可适当调整离心力。离心后淋巴细胞在血浆层，适当提高离心力；离心后淋巴细胞在分离液层，则适当降低离心力。
(3)若出现红细胞沉降不完全的情况，可以适当加大离心力。
(4)若出现血小板污染的情况，可适当降低离心力，同时分离后可增加洗涤次数。
(5)离心力的调整以50-100×g为基数，直至达到最佳分离效果。离心力最小不可小于400×g，最大不可大于1200×g。离心时间以20-30分钟为准。
(6)地域差异、四季温差及离心机性能差异等均会影响分离效果，可根据实际情况，调整离心条件。建议对离心条件进行调整时，恒定离心时间，对离心转速进行调整。
f.血浆层的吸取：小心、缓慢地吸取血浆层并转移到新的离心管中，勿触动PBMC层，可留少量血浆层。血浆层样品后续可用于血浆相关检测。如需获得纯度较高的血浆，建议仅吸取血浆层由上至下的2/3的血浆，剩余1/3血浆可能包含部分PBMC及少量分离液成分。离心后的分离效果示意图请参考图1，由上到下分为四层，依次为血浆层(含血小板)、乳白色环状层(即PBMC层)、透明分离液层和红细胞/粒细胞层。离心后须小心取出离心管，切勿摇晃或震动。
g.淋巴细胞的吸取：可直接穿过血浆层，小心、缓慢地吸取乳白色环状层(即PBMC层)并转移到新的离心管中(此方法技术要求高)，也可以在尽量吸除血浆层后再小心、缓慢地吸取乳白色环状层，并转移到新的离心管中。
注1：为避免吸取存在分离液交界处的粒细胞，请不要过多吸取淋巴细胞层。
注2：若吸取的淋巴细胞层混杂有红细胞，可使用红细胞裂解液(
C3702)将红细胞裂解，以去除红细胞，提高淋巴细胞分离率。
h.洗涤I：加入10ml PBS或HBSS (
C0218)，适当混匀，重悬细胞。250×g离心10分钟，弃上清。
i.洗涤II：加入5ml PBS或HBSS，适当混匀，重悬细胞。250×g离心10分钟，弃上清。重复本步骤2-3次。
j.所得沉淀即为分离的淋巴细胞，可加入0.5ml PBS或HBSS或根据后续实验要求加入相应溶液，重悬细胞。
参考文献：
1.Barbara J. Bain. Medicine. 2021. 49(4):183-188
2.Mathur A, Tripathi AS, Kuse M. J Pathol Inform. 2013. 4(Suppl): S15.
3.Sknepnek A, Tomić S, Miletić D, et al. Food Chem. 2021. 342:128344.
4.Udyavar A, Geiger TL. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2010. 58(5):335-46.
5.王兰兰主编. 医学检验专业必修课考试辅导教材, 临床免疫学和免疫检验, 科学技术文献出版社. 2004年10月第1版, 第111页.
6.Böyum A. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 1968. 97:77-89.
常见问题：
由于血液黏度、样品稀释倍数等差异可能产生的问题及解决方案如下表所示。
| Problem |
Cause |
Resolution |
| 离心后淋巴细胞存在于血浆层 |
离心力过小或离心时间过短 |
调整离心力 |
| 离心后淋巴细胞存在于透明分离液层中 |
离心力过大或离心时间过长 |
| 离心后乳白色环状层(淋巴细胞层)弥散 |
样品未稀释或者稀释倍数过低 |
调整样品稀释倍数 |
| 离心后乳白色环状层(淋巴细胞层)太浅或看不见 |
样品稀释倍数过高 |
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包装 |
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500ml |
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120ml |
| C3702-500ml |
红细胞裂解液 |
500ml |
| ST341-500ml |
生理盐水(0.9% NaCl, 无菌) |
500ml |
| ST476 |
PBS (10X) |
500ml |