使用说明：
1.实验前准备：
a．需自备水平转子离心机(离心力≥1200×g)。整个梯度离心要求是慢升慢降，需要设置离心机的加速度为1-3，关闭刹车，须自然停止。
b．抗凝剂的选择：若分离出的淋巴细胞直接用于检测，可选用枸橼酸钠抗凝剂；若分离出的淋巴细胞需进一步培养，则选用肝素抗凝剂。
c．血液样品应是新鲜抗凝血，避免冷藏或冷冻。血液样品离体2小时内分离效果最佳；血液样品离体2-4小时，分离效果尚可；血液样品离体4小时以上，分离效果差或无法进行分离操作。
d．为保证最佳分离效果，
整个实验过程要求检测样品、使用试剂、离心及实验室的温度均保持在20±2ºC。
2.血液样品的稀释(选做)：
a.可使用本试剂盒中样品稀释液对样品进行稀释，也可选用不含有钙镁离子缓冲液或生理盐水或培养基对样品进行稀释。推荐选择碧云天生产的PBS (
C0221A)和生理盐水(
ST341)。
b.按照血液样品:PBS或生理盐水=2:1的比例对血液样品进行稀释。
3.淋巴细胞的分离：
a.分离液和血液样品的加入：取一支新无菌硅化离心管(10ml)或15ml无菌离心管(需自备)，先加入一定量分离液；随后将管子小心地倾斜45度，并沿着壁管缓慢地加入血液样品，使样品顺着管壁缓慢滑动到接近分离液液面处，避免血液样品冲入液面下，此时血液样品平铺在分离液的液面上，注意保持两液面界面清晰，切勿搅动液面或摇晃、混匀。
注1：可以使用无菌巴氏吸管(
FPIP002/
FPIP004/
FPIP008)吸取血液样品或后续的血浆层、淋巴细胞。
注2：由于分离液和血液的密度差异，将形成明显的分层界面。如果样品较多导致加样时间较长，在离心前出现红细胞成团下沉属正常现象。
注3：如果使用特殊的外周血淋巴细胞分离管如SepMate™ PBMC Isolation Tube等进行分离，请同时参考该离心管的使用说明进行操作。
b.当样品体积在0.5-2.0ml范围内时，使用无菌硅化离心管(10ml)，先加入4ml分离液，然后加入血液样品，按步骤3c进行离心操作；当样品体积在2.0-4.0ml范围内时，使用15ml无菌离心管，先加入5ml分离液，然后加入血液样品，按步骤3d进行离心操作。
注1：可将血液样品和分离液置于20ºC水浴中孵育20分钟，以保证最佳分离温度。
注2：分离液体积不得少于3ml，血液样品不得少于0.5ml。
注3：如使用15ml无菌离心管，血液样品和分离液量总和不得超过10ml。
注4：请根据血液样本量确定离心条件，血液样品量越多，所需离心力越大，所需离心时间越长，具体离心条件需自行摸索，以达到最佳分离效果。
c.对于0.5-2.0ml血液样品量，推荐最佳离心条件为20ºC，450×g，离心30分钟。
d.对于2.0-4.0ml血液样品量，推荐最佳离心条件为20ºC，500×g，离心30分钟。
e.条件的优化：
(1)根据离心后乳白色环状层(淋巴细胞层)显现状态，调整样品稀释倍数。乳白色环状层弥散，应适当提高样品的稀释倍数；乳白色环状层很浅或没有，应适当降低样品的稀释倍数。
(2)根据离心后淋巴细胞存在的分层位置，可适当调整离心力。离心后淋巴细胞在血浆层，适当提高离心力；离心后淋巴细胞在分离液层，则适当降低离心力。
(3)若出现红细胞沉降不完全的情况，可以适当加大离心力。
(4)若出现血小板污染的情况，可适当降低离心力，同时分离后可增加洗涤次数。
(5)离心力的调整以50-100×g为基数，直至达到最佳分离效果。离心力最小不可小于400×g，最大不可大于1200×g。离心时间以20-30分钟为准。
(6)地域差异、四季温差及离心机性能差异等均会影响分离效果，可根据实际情况，调整离心条件。建议对离心条件进行调整时，恒定离心时间，对离心转速进行调整。
f.血浆层的吸取：小心、缓慢地吸取血浆层并转移到新的离心管中，勿触动PBMC层，可留少量血浆层。血浆层样品后续可用于血浆相关检测。如需获得纯度较高的血浆，建议仅吸取血浆层由上至下的2/3的血浆，剩余1/3血浆可能包含部分PBMC及少量分离液成分。离心后的分离效果示意图请参考图1，由上到下分为四层，依次为血浆层(含血小板)、乳白色环状层(即PBMC层)、透明分离液层和红细胞/粒细胞层。离心后须小心取出离心管，切勿摇晃或震动。
g.淋巴细胞的吸取：可直接穿过血浆层，小心、缓慢地吸取乳白色环状层(即PBMC层)并转移到新的离心管中(此方法技术要求高)，也可以在尽量吸除血浆层后再小心、缓慢地吸取乳白色环状层，并转移到新的离心管中。
注1：为避免吸取存在分离液交界处的粒细胞，请不要过多吸取淋巴细胞层。
注2：若吸取的淋巴细胞层混杂有红细胞，可使用红细胞裂解液(
C3702)将红细胞裂解，以去除红细胞，提高淋巴细胞分离率。
h.洗涤I：加入10ml清洗液或PBS或HBSS (
C0218)，适当混匀，重悬细胞。250×g离心10分钟，弃上清。
i.洗涤II：加入5ml清洗液或PBS或HBSS，适当混匀，重悬细胞。250×g离心10分钟，弃上清。重复本步骤2-3次。
j.所得沉淀即为分离的淋巴细胞，可加入0.5ml清洗液或PBS或HBSS或根据后续实验要求加入相应溶液，重悬细胞。
参考文献：
1.Barbara J. Bain. Medicine. 2021. 49(4):183-188.
2.Mathur A, Tripathi AS, Kuse M. J Pathol Inform. 2013. 4(Suppl): S15.
3.Sknepnek A, Tomić S, Miletić D, et al. Food Chem. 2021. 342:128344.
4.Udyavar A, Geiger TL. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 2010. 58(5):335-46.
5.王兰兰主编. 医学检验专业必修课考试辅导教材, 临床免疫学和免疫检验, 科学技术文献出版社. 2004年10月第1版, 第111页.
6.Böyum A. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 1968. 97:77-89.
7.Kim EM, Oh PS, Boud F, Jeong HJ, Lim ST, Sohn MH. Nucl Med Mol Imaging. 2020. 54(3):147-155.
8.Dawson HD, Li NQ, DeCicco KL, Nibert JA, Ross AC. J Nutr. 1999. 129(8):1510-7.
常见问题：
由于血液黏度、样品稀释倍数等差异可能产生的问题及解决方案如下表所示。
| Problem |
Cause |
Resolution |
| 离心后淋巴细胞存在于血浆层 |
离心力过小或离心时间过短 |
调整离心力 |
| 离心后淋巴细胞存在于透明分离液层中 |
离心力过大或离心时间过长 |
| 离心后乳白色环状层(淋巴细胞层)弥散 |
样品未稀释或者稀释倍数过低 |
调整样品稀释倍数 |
| 离心后乳白色环状层(淋巴细胞层)太浅或看不见 |
样品稀释倍数过高 |
相关产品：
| 产品编号 |
产品名称 |
包装 |
| C0025-200ml |
人外周血淋巴细胞分离液 |
200ml |
| C0027S |
大鼠外周血淋巴细胞分离试剂盒 |
200ml |
| C0029S |
小鼠外周血淋巴细胞分离试剂盒 |
200ml |
| C0031S |
兔外周血淋巴细胞分离试剂盒 |
200ml |
| C0218 |
Hanks' Balanced Salt Solution |
500ml |
| C0221A |
PBS |
500ml |
| C3702-120ml |
红细胞裂解液 |
120ml |
| C3702-500ml |
红细胞裂解液 |
500ml |
| ST341-500ml |
生理盐水(0.9% NaCl, 无菌) |
500ml |
| ST476 |
PBS (10X) |
500ml |