使用说明：
本步骤以96孔板，每孔接种100μl细胞为例，如使用其它类型的多孔板，各试剂使用量请按照相应比例进行换算。
1.3D细胞的准备。
在96孔3D培养板中每孔接种100μl细胞，细胞的接种量根据具体的实验方案，例如培养天数、需要的3D细胞球状体的大小等确定，按照3D细胞培养方案培养细胞，并按照实验设计进行一定的处理。96孔3D培养板推荐使用碧云天的3D细胞培养板包被液(
C0365)、3D细胞培养包被试剂盒(U形底96孔板) (
C0366)包被的U形底96孔板，或直接使用BeyoGold™超低吸附96孔板(
FULA962/
FULA961)、BeyoGold™超低吸附黑色透明底96孔板(平底带盖，独立包装) (
FULA965)等。
注：为达到最佳的染色效果，具体的细胞球培养时间等可以根据细胞种类、具体的实验需求等进行调整。例如，对于HCT-116细胞，通常接种培养48小时形成较为紧实的细胞球后进行染色效果较好。
2.3D细胞固定(选做)。
小心去除孔内培养液，每孔加入100μl免疫染色固定液(
P0098)或4%多聚甲醛固定液(
P0099)，室温固定细胞10分钟。
注1：为达到最佳的使用效果，具体的固定时间可以根据细胞种类、培养天数、细胞球状体大小等进行调整。
注2：固定细胞球等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
3.3D细胞DiI染色。
a.Beyo3D™ DiI染色工作液的用量：对于6、12、24、96孔板，每孔Beyo3D™ DiI染色工作液的用量分别为0.5~1ml、200~500μl、100~200μl和50~100μl。
b.Beyo3D™ DiI染色工作液的配制：如下表所示，按照96孔板每孔需要100μl Beyo3D™ DiI染色工作液的量，用染色缓冲液稀释配制适量的Beyo3D™ DiI染色工作液。
| 样品数 |
10 samples |
50 samples |
100 samples |
| Beyo3D™ DiI (200X) |
5μl |
25μl |
50μl |
| 染色增强剂(400X) |
2.5μl |
12.5μl |
25μl |
| 染色缓冲液 |
992.5μl |
4.962ml |
9.925ml |
| Beyo3D™ DiI染色工作液 |
1ml |
5ml |
10ml |
注1：配制好的Beyo3D™ DiI染色工作液必须一次使用完毕，不能冻存。
注2：Beyo3D™ DiI染色工作液中的DiI的最终浓度可以根据不同细胞系和实验体系通过预实验进行优化。DiI的工作浓度通常为0.5-2X，推荐使用浓度为1X。DiI的最终浓度改变时，染色增强剂的用量可以不变。
c.染色：小心吸除原有细胞培养液，沿着孔壁缓慢加入100μl Beyo3D™ DiI染色工作液，在适宜于细胞培养的温度避光孵育15分钟。
注1：为达到最佳的染色效果，具体染色时间可以根据细胞种类、培养天数、细胞球状大小等进行调整。
注2：任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。3D细胞球通常位于在培养板或培养皿等培养器皿的底部，培养板在对着光线时能看到孔内针尖大小的乳白色细胞球，吸除孔内液体时须尽量避开细胞球以免将细胞球吸走。可以根据孔内液体的体积将移液器调至合适的量程，例如需要吸除的液体体积为100μl，将200微升移液器的量程调整到50-70微升，避开细胞球从液体边缘缓慢、分次吸除。孔内加入液体时，沿着孔壁小心、缓慢加入，避免破坏或吹散3D细胞球。
4.荧光检测。
a.荧光显微镜检测。孵育结束后，小心去除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后在荧光显微镜下观察荧光染色效果。注意整个过程均需注意避光操作。
注：任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
b.荧光酶标仪检测。孵育结束后，小心吸除孔内染色液，沿着孔壁缓慢加入适量的PBS洗涤细胞球1次并更换为完全培养液，随后用荧光酶标仪检测(DiI为红色荧光，Ex/Em=549/565nm)。
注：任何液体吸除或加入的过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。
参考文献：
1.Kapałczyńska M, Kolenda T, Przybyła W, Zajączkowska M, Teresiak A, et al. Arch Med Sci. 2018. 14(4):910-919.
2.Riedl A, Schlederer M, Pudelko K, Stadler M, Walter S, et al. J Cell Sci. 2017. 130(1):203-218.
3.Hoarau-Véchot J, Rafii A, Touboul C, Pasquier J. Int J Mol Sci. 2018. 19(1):181.
4.Ravi M, Paramesh V, Kaviya SR, Anuradha E, Solomon FD. J Cell Physiol. 2015. 230(1):16-26.
5.Antoni D, Burckel H, Josset E, Noel G. Int J Mol Sci. 2015. 16(3):5517-27.
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1/5/20个 |
| FULA243 |
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1/5/20个 |
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BeyoGold™超低吸附96孔板(平底带盖, 独立包装) |
1/6/24个 |
| FULA962 |
BeyoGold™超低吸附96孔板(圆底带盖, 独立包装) |
1/6/24个 |
| FULA965 |
BeyoGold™超低吸附黑色透明底96孔板(平底带盖, 独立包装) |
1/6/24个 |
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1/6/24个 |
| FULA985 |
BeyoGold™超低吸附黑色透明底384孔板(平底带盖, 独立包装) |
1/6/24个 |
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10个/袋 |
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BeyoGold™超低吸附35mm培养皿 |
10个/袋, 4袋/箱 |
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BeyoGold™超低吸附60mm培养皿 |
10个/袋 |
| FULA060-40pcs |
BeyoGold™超低吸附60mm培养皿 |
10个/袋, 4袋/箱 |
| FULA100-10pcs |
BeyoGold™超低吸附100mm培养皿 |
10个/袋 |
| FULA100-40pcs |
BeyoGold™超低吸附100mm培养皿 |
10个/袋, 4袋/箱 |