使用说明：
1.引物设计：引物长度在18-22bp左右，GC含量在45%-60%之间，Tm>55℃，引物扩增的片段长度在500-1000bp之间，且突变位点最好不要在扩增片段正中央，以便酶切形成两个不同大小的片段便于进行电泳观察。
2.样品准备: 对于细胞样品，收集约5-100万个细胞(不推荐超过200万个细胞)沉淀至PCR管中，或者如果经基因编辑的细胞接种在96孔板中，待细胞长至80-100%融合度时吸除培养液后备用。对于组织样品，总量约为1-5mg，不建议超过10mg，放至PCR管中。
3.基因组DNA提取：
a.消化液的配制。根据样本数量参考下表配制消化液，并充分混匀。
| Component |
1 Sample |
10 Samples |
| DNA Extraction Solution |
48μl |
480μl |
| Enzyme Mix |
2μl |
20μl |
注：裂解液需现配现用，并充分混匀后使用。
b.基因组DNA的提取。每个样品加入50μl消化液。对于细胞沉淀，适当充分重悬；对于培养在96孔板中的细胞，作用1min后，适当吹打并全部转移至PCR管中；对于组织样品，可以适当反复吹打数次。按照以下条件在PCR仪或水浴锅(优先推荐使用PCR仪)进行孵育反应。
| Temperature |
Time |
| 68℃ |
15min |
| 95℃ |
10min |
| 4℃ |
hold |
注：反应结束后立即进行后续的PCR扩增或在-20℃保存。
4.PCR扩增。首次扩增建议参考下表设置不同的实验组以确保实验的顺利进行。
| Group |
Template |
| Sample |
Genomic DNA from Cells with Gene Editing |
| Negative Control |
Genomic DNA from Cells without Gene Editing |
| Positive Control |
Template Provided by this Kit |
| Blank Control |
Water |
a.PCR反应体系如下。
| Component |
Sample |
Positive Control |
Blank Control |
| Genomic DNA |
1μl |
- |
- |
| Primer Mix (10μM each) |
0.5μl |
- |
0.5μl |
| Control Templates & Primers |
- |
0.5μl |
- |
| BeyoFusion™ Master Mix (2X) |
10μl |
10μl |
10μl |
| Nuclease-free Water |
8.5μl |
9.5μl |
9.5μl |
| Total |
20μl |
20μl |
20μl |
b.用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
c.把配制好的PCR反应体系置于PCR仪上，开始PCR反应。
d.PCR反应参数的设置如下。
| Step |
Temperature |
Time |
Cycles |
| Initial Denaturation |
95℃ |
3min |
1 |
| Denaturation |
95℃ |
20sec |
35 |
| Annealing |
55℃ |
30sec |
| Extension |
72℃ |
30sec |
| Final Extension |
72℃ |
5min |
1 |
| Hold |
4℃ |
- |
- |
e.选做：PCR结束后，每样取少量PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测目的条带是否单一和大小是否正确，如果正确则进行下一步实验。如果前期做过预实验，对于PCR扩增比较有把握，可以忽略本步骤。
5.变性与退火：
a.按下表配制变性与退火体系。
| Component |
Volume |
| PCR Product |
5μl |
| 10X Reaction Buffer |
2μl |
| Nuclease-free Water |
12μl |
| Total |
19μl |
注：扩增的PCR产物无需进一步纯化即可用于变性与退火。每个变性与退火反应所使用的PCR产物的量宜在50-250ng范围内，PCR产物用量过少，会导致后续电泳条带偏弱；PCR产物用量过多，会导致后续T7EI酶切不太充分。
b.按照下表的步骤，在PCR仪上进行变性和退火。
| Step |
Temperature |
Time |
| Denaturation |
95℃ |
5min |
| Annealing |
95℃-85℃ |
-2℃/sec |
| 85℃-25℃ |
-0.1℃/sec |
| Hold |
4℃ |
- |
6.T7EI酶切鉴定：
a.在变性和退火完成后，每管加入1μl的T7EI。
b.37℃酶切15min。如果把酶切时间延长至15-60min也是完全可以的，但酶切15分钟通常已经足够酶切充分了。
c.酶切完成后建议立即进行凝胶电泳分析，如果不能立即进行凝胶电泳分析，推荐加入1μl 0.1mM EDTA后-20℃保存。也可以80℃加热15min以失活T7EI酶后-20℃保存。
7.凝胶电泳分析：
a.T7EI酶切反应结束后，向反应体系中加入4μl 6X DNA上样缓冲液(D0071)，然后使用2%琼脂糖凝胶进行电泳分析。
b.使用凝胶成像系统拍摄电泳图像，并使用凝胶分析软件确定每个条带中所含不同长度的DNA的相对比例。
c.基因编辑效率的计算：
(a)对于基因编辑产生随机突变的情况：
剪切比例(Fraction Cleaved) = 被剪切条带的灰度总和(Sum of cleaved band intensities) / 剪切条带和未被剪切的特异性条带的灰度总和(Sum of cleaved band intensities and specific parental band intensities)
Fraction Cleaved = (% gene modification) × (1 - % gene modification) + (% gene modification)，求解可得：
基因编辑效率(% gene modification) = 100 × (1 - (1 - Fraction Cleaved)1/2)
例如，当Fraction Cleaved = 75%时(即剪切条带的灰度总和为剪切条带和未被剪切的特异性条带的灰度总和的75%时)，基因编辑效率 = 50%。即当基因编辑效率为50%时，理论上观察到的剪切条带的灰度总和占所有特异性条带灰度总和的约75%。因为基因编辑发生时，例如CRISPR/Cas9，不会仅产生单一的一种基因编辑，而是会产生多种不同的插入或缺失突变，各种不同的插入和突变缺失体之间也能退火形成不完全匹配的双链DNA，并且能被T7EI所剪切的。
(b)对于基因编辑仅产生特定突变的情况：
剪切比例(Fraction Cleaved) = 被剪切条带的灰度总和(Sum of cleaved band intensities) / 剪切条带和未被剪切的特异性条带的灰度总和(Sum of cleaved band intensities and specific parental band intensities)
Fraction Cleaved = (% gene modification) × (1 - % gene modification) × 2，求解可得：
基因编辑效率(% gene modification) = 100 × (0.5 ± 0.5 × (1 – 2 × Fraction Cleaved)1/2)
例如，当Fraction Cleaved = 37.5%时(即剪切条带的灰度总和为剪切条带和未被剪切的特异性条带的灰度总和的37.5%时)，基因编辑效率 = 25%或75%。即当基因编辑效率为25%或75%时，理论上观察到的剪切条带的灰度总和占所有特异性条带灰度总和的约37.5%。
常见问题：
1.PCR扩增问题:
a.样品PCR扩增后无条带：如果PCR后样品管检测不到目的条带，而使用试剂盒提供的Control Templates & Primers能扩增出预期的条带，则可能需要重新设计引物，或调整退火温度。
b.拖带现象：细胞或组织样品裂解后提取的基因组DNA浓度过高，可尝试将基因组DNA稀释3-10倍后再进行PCR反应。
c.条带太弱：细胞裂解后提取的基因组DNA浓度过低，可尝试将PCR反应中基因组DNA的用量加倍。
注：请勿在PCR反应中使用超过2μl的裂解液，因为过多的裂解液会抑制PCR反应。
2.T7EI酶切问题：
a.样品条带没有被酶切：如果使用试剂盒提供的阳性对照Control Templates & Primers的扩增产物可以被T7EI酶切并产生剪切条带，而所需检测的样品没有检测到目的条带被剪切，可能由如下原因导致：
(a)样品基因确实并没有被成功编辑，或者编辑的效率太低了。可以考虑尝试重新进行基因编辑(包括对于CRISPR/Cas9重新设计guide RNA，设法提高转染或感染效率。
(b)PCR引物离酶切位点过近。可以尝试重新设计距离酶切靶点更远的引物。
(c)遗漏了变性和退火步骤。此时阳性对照Control Templates & Primers的扩增产物也是不能被酶切的。
b.酶切产生的条带特别弱：可能需要重新设计或优化基因组编辑实验的条件，以提高基因编辑效率。也可以考虑后续筛选多克隆或单克隆细胞，以确保大部分细胞或所有细胞都发生基因编辑，便于用于后续的实验。
c.酶切产生了非特异性条带：
(a)酶切时间过长或者酶过量。需要设置未进行基因编辑的阴性对照以区分背景和特异性剪切产生的条带。
(b)酶切位点附近产生了非预期的突变，需要重新设计引物，以适当避免相应的非预期的突变位点。
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