使用说明：
1.溶解并混匀体外消化反应所需的各种溶液。将Cas9 Nuclease、gRNA、底物DNA置于冰浴上，使用无核酸酶水稀释gRNA至300nM，底物DNA至30nM。
2.按照下表配制反应体系(以30μl体系为例)：
| Reagent |
Volume |
| Nuclease-free Water |
20µl |
| Cas9 Reaction Buffer (10X) |
3µl |
| gRNA (300nM) |
3µl |
| Cas9 Nuclease (1μM) |
1µl |
| Total Reaction Volume |
27µl |
3.用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。25℃预孵育10min。
4.加入3μl 30nM底物靶DNA (30μl最终体积)，轻轻混匀(用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀)，随后离心沉淀液体，37℃孵育15min，反应时间可以根据实际情况适当延长至例如30-120min。
5.每个样品中加入1μl
蛋白酶K (ST532)，轻轻混匀， 室温孵育10min。
6.每个反应体系中加入6μl
DNA上样缓冲液(6X) (D0071)，然后使用适当浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分析。如果不立即电泳，可以-20℃保存备用。
常见问题：
1.为什么观察到目的DNA切割不完全?
a.可能是由于Cas9 Nuclease、sgRNA、target DNA的比例不合适引起的，推荐Cas9 Nuclease、sgRNA、target DNA的摩尔比例至少为10:10:1。也可以通过适当延长反应时间使反应更加充分。
b.可能与sgRNA的序列有关，可以根据target DNA选择更合适的sgRNA序列，不同的sgRNA的效果会差别比较大。
c.可能由于sgRNA降解引起的，可以通过凝胶电泳验证sgRNA的完整性。
参考文献：
1.Nishimasu H, Ran FA, Hsu PD, Konermann S, Shehata SI, Dohmae N, Ishitani R, Zhang F, Nureki O. Cell. 2014.156(5):935-49.
2.Marangi M, Pistritto G. Front Pharmacol. 2018. 9:396.
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