使用说明：
1.PCR反应体系的设置：
a.融解并混匀PCR反应所需的各种溶液。BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X)完全融解并混匀后置于冰浴上或冰盒内。
b.参考下表在室温或冰浴上设置PCR反应体系(以96孔板为例)：
| Reagent | Volume for One PCR Reaction (20μl) |
| BeyoFast™ Probe qPCR Mix (2X) | 10µl |
| Forward and Reverse Primer Mix (3μM each) | 2μl |
| Probe | 0.5μl |
| Template DNA | 2μl |
| RNase-Free Water | 5.5μl |
注意：(1) 通常引物的终浓度为0.2-0.5μM时可获得良好的检测效果，也可根据情况在0.1-1.0μM范围内调整引物的终浓度。
(2) 最佳的探针(probe)浓度，与使用的荧光定量PCR仪、探针种类、荧光标记物质种类有关。实际使用时请参考仪器说明书，或各荧光探针的具体使用要求进行探针浓度的调节。通常探针的浓度宜低于引物的浓度，例如引物终浓度为0.3μM ，则推荐的探针终浓度为0.2μM，可在0.1-0.3μM范围内调整探针的终浓度。
(3) 通常DNA模板的量以1-10ng cDNA或10-100ng基因组DNA为参考用量。因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数不同，如有必要，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。RT-PCR反应得到的cDNA直接作为模板时，其添加量不要超过PCR反应总体积的10%。
(4) 96孔板的推荐反应体系为20µl，也可以根据实际实验需求，按比例扩大或缩小反应体系。
(5) 建议设置不加模板的阴性对照组。
c.用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀，室温离心数秒，使液体积聚于管底。
d.将设置好的PCR反应管或PCR反应板置于荧光定量PCR仪上，开始PCR反应。
2.PCR反应程序：
在Real-time PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃ 2分钟，复杂或高GC模板适当延长时间至5分钟。本产品中的BeyoFast™ Taq DNA Polymerase可以在15秒内可完成至少300bp的扩增，可以满足绝大多数的qPCR实验；对于超过350bp或者高GC含量的扩增子，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。建议采用如下的PCR程序，本程序是以ABI 7900HT荧光定量PCR仪为例：
a.预变性：95℃ 2min
b.变性：95℃ 15sec
c.退火/延伸：60℃ 15-30sec
d.重复步骤b和步骤c，总共40个循环
e.使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果
三步法只需在退火/延伸后加一步72℃ 30sec，随后重复步骤b、c及增加的这一步骤共40个循环即可。
注：以上举例为常规qPCR反应系统，仅供参考。实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异，需根据模板、引物、目的片段的特点设定最佳反应条件，并根据比例放大或缩小反应体系。
常见问题：
1.荧光定量PCR结果不理想，出现特异性不好或扩增效率不高时，可能是由于以下原因造成：
a.引物设计不佳。请选择适当的引物设计软件进行引物设计，注意引物的GC含量、二级结构、二聚体、退火温度、长度、特异性等方面的问题。也可以尝试使用有文献报道使用过的引物，或者从碧云天订购经过测试的qPCR引物。
b.待扩增片段GC含量偏高。GC含量较高的情况下PCR会变得相对比较困难，此时宜更换引物。
c.PCR反应体系在室温设置时容易导致非特异性条带，但在使用热启动酶时可以有效避免室温操作导致的非特异性条带的产生。但对于一些较难扩增的产物，可以尝试在冰浴上设置PCR反应体系，以进一步减少非特异性的DNA扩增。
d.退火温度不佳，需要优化。这种情况下宜更换引物。
e.待扩增片段GC含量较高或长度较长，变性不够充分。此时宜更换引物，使待扩增片段的GC含量和长度适中。
f.模板量太低，此时宜适当加大模板量。
g.模板中含有抑制PCR反应的物质，可以用适当的DNA纯化方法例如柱纯化等纯化模板DNA。
2.反应条件优化方法：
a.引物浓度：通常引物终浓度为0.3μM时可获得良好检测效果，终浓度可以在0.1-1.0μM范围内适当调整。如果希望提高反应特异性，可降低引物浓度；如果希望提高扩增效率，可增加引物的浓度，从而优化反应体系。
b.探针浓度：通常探针终浓度为0.2μM时可获得良好检测效果，终浓度可以在0.1-0.5μM范围内适当调整，但不宜超过引物的终浓度。
c.退火温度：建议采用两步法PCR，退火温度60℃进行反应。如果希望提高反应特异性，可提高退火温度，以60-64℃作为退火温度的调整范围。在引物Tm值较低而得不到良好的实验结果时，可尝试进行三步法PCR扩增，三步法的退火温度请以56-64℃作为温度设置的参考范围。
d.延伸时间：建议采用两步法PCR，延伸15-30秒。对于超过350bp或者高GC含量的扩增子，建议增加延伸时间至60秒或者采用三步法以提高扩增效率。
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