使用说明：
1.首次使用1µg包装的本产品时，请先取少量本质粒转化大肠杆菌，进行质粒小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。抽提获得的质粒可以通过酶切电泳进行鉴定，或通过测序进行鉴定。
2.100µg包装的本产品质粒浓度为0.1µg/µl，共1ml。可以直接用于酶切或者转染细胞。
3.本质粒构建方案如下，仅供参考。
a.质粒酶切和去磷酸化。
| Reagent |
Volume |
| pLenti-U6-gRNA-Cas9-P2A-mCherry-Hygro |
xμl (1-2μg) |
| FastDigest BsmBI |
1μl |
| BeyoAP Alkaline Phosphatase (D7027) |
1μl |
| 10X FastDigest Buffer |
2μl |
| 100mM DTT |
0.2μl |
| ddH2O |
(15.8-x)μl |
| Total volume |
20μl |
| Incubate at 37℃ for 30min |
b.使用DNA凝胶回收试剂盒纯化酶切后的质粒。
如果质粒成功被BsmBI酶切，则会产生两个片段，一个大的为目的片段，小片段为filler。酶切电泳鉴定后，切胶胶回收12kb的目的条带，弃去约2kb的filler条带。
c.磷酸化和退火Oligos。
| Reagent |
Volume |
| sgRNA oligo 1 (100μM) |
1μl |
| sgRNA oligo 2 (100μM) |
1μl |
| 10X T4 Ligation Buffer |
1μl |
| ddH2O |
6.5μl |
| T4 Polynucleotide Kinase (D7096) |
0.5μl |
| Total volume |
10μl |
设计Oligo的原则如下：
Forward: 5'-CACCG-20bp-3'
Reverse: 5'-AAAC-20bp (Copy bottom strand 5'->3')-C-3'
注1：反应中请使用T4 Ligation Buffer，因为随
T4 Polynucleotide Kinase (D7096)提供的缓冲液不包含ATP。如果使用随
T4 Polynucleotide Kinase (D7096)提供的缓冲液，请补充1mM ATP。
注2：使用以下参数将磷酸化/退火反应放入热循环仪中：37℃ 30min，95℃ 5min，然后以5℃/min的速度下降到25℃。
d.将步骤3c中退火的双链寡核苷酸以1:200的比例稀释到超纯水中。
e.按照常规连接方式进行连接反应。
取50ng步骤3b中经BsmBI酶切且纯化后的质粒，与1μl步骤3d中稀释后的双链寡核苷酸进行连接，具体连接用量与步骤参照所使用的连接试剂盒说明书进行。推荐使用碧云天生产的
快速DNA连接试剂盒(D7002/D7003)进行连接反应。建议同时设置阴性对照(仅含有载体，用水代替退火的双链寡核苷酸)。
f.转化至Stbl3菌。
本质粒包含长末端重复序列(LTR)，适合转化至重组缺陷菌，使用
Stbl3甘油菌(D0378)能够获得的质粒产量。尽管其它RecA菌株可能有效，但我们测试发现使用Stbl3的转化效率和质粒产量都总体更加理想。
g.直接转染细胞或进行慢病毒的包装。
推荐使用碧云天生产的
Lipo8000™转染试剂(C0533)转染细胞。构建好的质粒后续也可以和
pCMV-VSV-G (D8215)以及
pCAG-dR8.9 (D8216)配合使用进行慢病毒的包装。
参考文献：
1.Mautino MR. Curr Gene Ther. 2002. 2(1):23-43.
2.Sumimoto H, Kawakami Y. Future Oncol. 2007. 3(6):655-664.
3.Stripecke R, Koya RC, Ta HQ, Kasahara N, Levine AM. Blood Cells Mol Dis. 2003. 31(1):28-37.
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