使用说明：
通常一次RIP反应(即使用一种抗体进行一次免疫沉淀)需要50-200万个细胞，所需Lysis Buffer 100-400µl，所需细胞量取决于目标RNA结合蛋白的表达丰度和所结合的RNA的丰度。用户可根据所研究的RNA结合蛋白和RNA靶标的丰度的不同，调整RIP实验所使用的细胞量及对应的Lysis Buffer用量。完整的RIP一般包括阴性对照IgG组、阳性对照组和目的蛋白组。本使用说明以一次RIP反应需要使用150万个细胞，所需Lysis Buffer 300µl为例。
1.洗涤Protein A/G Agarose。
由于Protein A/G Agarose储存在特殊保护液中，所以需要在加入样品前适当洗涤。
a.用移液器轻轻吹打重悬Protein A/G Agarose，按照每300μl样品需30μl Protein A/G Agarose悬浊液，取适量Protein A/G Agarose至一洁净离心管中(FTUB015)，加入1ml NT2 Wash Buffer。
b.用移液器轻轻吹打重悬Protein A/G Agarose。4ºC，约1000×g离心1分钟，去除上清。共重复洗涤三次。
2.Protein A/G Agarose与抗体预结合。
a.按照每30μl Protein A/G Agarose悬浊液需100μl NT2 Wash Buffer的量，取适量NT2 Wash Buffer加入到洗涤后的Protein A/G Agarose中，适当重悬。
b.根据实验设计，加入适量一抗(目的蛋白特异性抗体、阳性对照抗体或阴性对照IgG)，室温孵育30分钟或4ºC摇床孵育1-4小时。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)或BeyoVortex™基础型旋转混匀仪(E6800)。
注1：高质量的抗体是保证RIP实验成功的关键因素，抗体的用量与抗体的纯度和效价、目的蛋白的丰度等有关。
注2：目的蛋白特异性抗体需自备，用量可以参考相应抗体的说明书。如果抗体的说明书中未给出用于RIP的稀释比例，可以参考普通的免疫沉淀的稀释比例，通常用量为1-5μg。
注3：阴性对照IgG加入量应当和目的蛋白特异性抗体加入量保持一致。
3.样品的制备。
a.对于贴壁细胞，吸除细胞培养液，PBS洗涤一次；对于悬浮细胞，离心收集细胞后，PBS洗涤一次。如需细胞计数，可在平行孔或皿中加入胰酶消化细胞或用细胞刮(FSCP023/FSCP029)刮离细胞后进行细胞计数。
b.一次RIP反应按照每150万个细胞加入300μl Lysis Buffer的比例加入Lysis Buffer。用移液器吹打数下，使Lysis Buffer和细胞充分接触以有效裂解细胞。
注：Lysis Buffer中需加入终浓度为1mM的DTT、100U/ml的RNase Inhibitor和0.2mM的PMSF。例如配制1ml Lysis Buffer，需同时向Lysis Buffer中加入2μl 0.5M DTT、2.5μl 40U/μl RNase Inhibitor和2μl 100mM PMSF。
c.在冰浴上孵育5-15分钟，以充分裂解细胞。
d.充分裂解后(对于贴壁细胞，如有必要可以用细胞刮刮离并收集细胞)，4ºC，14,000×g离心10分钟，取上清即为制备好的细胞样品裂解液。取出30μl (一次RIP反应的10%裂解液)样品作为Input用于后续检测。Input须-80ºC保存。
e.对于组织样品，通常按照15-30mg组织加入300μl Lysis Buffer的比例加入Lysis Buffer，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、Tissue Master™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下匀浆。将匀浆液在4ºC，14,000×g离心10分钟，取上清即为制备好的组织样品裂解液。取出30μl (一次RIP反应的10%裂解液)样品作为Input用于后续检测。Input须-80ºC保存。
注：本步骤加入的Lysis Buffer同步骤3b，也需要在Lysis Buffer中需加入终浓度为1mM的DTT、100U/ml的RNase Inhibitor和0.2mM的PMSF。
4.免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)。
a.步骤2中Protein A/G Agarose与抗体预结合后，4ºC，约1000×g离心1分钟，去除预结合完毕Protein A/G Agarose的上清。
b.取270μl细胞或组织样品裂解液，加入到抗体预结合Protein A/G Agarose中，颠倒混匀后，4ºC摇床孵育4小时，也可以根据实际情况孵育更长时间或过夜。
注1：根据测试，样品孵育的时间越长，免疫沉淀的效果可能会更好，但也存在RNA降解的风险。一般建议4ºC摇床孵育4小时。
注2：也可先将目的蛋白特异性抗体或阴性对照IgG与样品4ºC摇床孵育4小时或过夜后，再加入30μl Protein A/G Agarose悬浊液室温孵育30分钟。
5.洗脱。
a.4ºC，约1000×g离心1分钟，去除上清。
b.加入1ml的NT2 Wash Buffer，用移液器轻轻吹打重悬Protein A/G Agarose，4ºC，约1000×g离心1分钟，共重复洗涤四次，最后弃上清。
c.加入100μl Elution Buffer，混悬均匀后，55ºC孵育30分钟。
6.RNA纯化。
参考碧云天RNAeasy™动物RNA抽提试剂盒(离心柱式) (R0027)，将Elution Buffer与Protein A/G Agarose的混合液与RNAeasy™动物RNA抽提试剂盒的结合液混合，进行过柱纯化RNA。步骤3d中Input组(30μl)用RNase-free Water补足体积至100μl，与其它样品体积保持一致，同时进行RNA纯化。纯化好的RNA可以立即进行后续实验或-80ºC保存。RNase-free Water推荐使用BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile) (ST876)。
注：本实验对DNA残留较敏感，如有必要可以在纯化的过程中需按RNAeasy™动物RNA抽提试剂盒(离心柱式) (R0027)中的建议添加DNase I去除DNA。
7.RNA分析或验证。
如果RBP的结合靶标未知，或者探索新的结合靶标，可以通过高通量测序来检测和分析结合的RNA。如果已知或有候选的RBP的结合RNA，RNA的分析可以通过设计特异性引物序列，使用qRT-PCR分析验证。
a.反转录可以酌情使用具有Oligo(dT)、Random primers或特定引物。Oligo(dT)适合用于带有Poly(A)尾的RNA的反转录，Random primers适合用于任何长链RNA的反转录，小RNA的反转录需要使用专门适合小RNA的qRT-PCR定量方法。推荐使用碧云天的BeyoRT™ Q cDNA第一链合成试剂盒(D7190)。
注：由于蛋白结合RNA的量比较低，一步法的qRT-PCR试剂盒的效果可能会欠佳，推荐使用两步法进行qRT-PCR检测，即先进行反转录，再进行qPCR。
b.qPCR检测推荐参考BeyoFast™ SYBR Green qPCR Mix (2X) (D7501/D7503/D7507/D7260/D7262/D7265)，注意引物退火温度，建议根据引物Tm值调整退火温度，如果希望提高反应特异性，可提高退火温度。
c.qPCR数据处理：根据2-△C t和2-△△C t公式计算RIP中目标RNA占Input中RNA的比例(%Input)和目标基因相当于阴性对照的富集倍数(Fold Enrichment)：
ΔCt [RIP]=Ct [RIP] – (Ct [Input] – Log2(Input Dilution Factor))，Input Dilution Factor为Input组稀释倍数，即若最初保留的Input为30μl (一次RIP反应的10%蛋白裂解液)样品，则稀释倍数为10。
%Input = 2(-ΔCt[RIP])
ΔΔCt [RIP/IgG]= Ct [RIP] – Ct [IgG]
RIP Fold enrichment = 2(-ΔΔCt [RIP/IgG])。
举例：经qPCR测定，RIP阳性对照组(HuR)的Ct值为22.6、阴性对照IgG组的Ct值为29.7、Input组的Ct值为19.3，Input稀释倍数为10。
则ΔCt [HuR]=Ct [HuR] – (Ct [Input] – Log2(Input Dilution Factor))=22.6-(19.3- Log210)=6.62
% Input (HuR)= 2(-ΔCt[HuR])=2-6.62=1%
ΔCt [IgG]=Ct [IgG] – (Ct [Input] – Log2(Input Dilution Factor))=29.7-(19.3- Log210)=13.72
% Input (IgG)= 2(-ΔCt[HuR])=2-13.72=0.0074%
ΔΔCt [HuR/IgG]=22.6-29.7=-7.10
Fold Enrichment of RNA (HuR/IgG)= 2(-ΔΔCt [HuR /IgG])= 2(-(-7.10))=137.2
参考文献：
1.Gygi SP, Rochon Y, Franza BR, Aebersold R. Mol Cell Biol. 1999. 19(3):1720-30.
2.Tenenbaum SA, Carson CC, Lager PJ, Keene JD. Proc Natl Acad Sci USA. 2000. 97(26):14085-90.
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