腺病毒包装方法和步骤
1.构建携带目的基因的穿梭质粒将其线性化
(1)将目的基因克隆到pShuttle质粒(D8115-D8137)的多克隆位点区，构建携带目的基因的pShuttle质粒。
(2)构建好的质粒转化到大肠杆菌DH5α中进行扩增，可以选购DH5α甘油菌(D0351)用于制备感受态来扩增构建好的pShuttle质粒，挑取单克隆培养过夜，小量抽提试剂盒提取质粒，推荐使用碧云天质粒小量抽提试剂盒(通用型)(D0007)。后续至少需要2μg的质粒，1μg用来后续重组，1μg用来做对照。
(3)将抽提好的质粒用Pme I酶切线性化，跑核酸电泳确定质粒线性化效果。
(4)将线性化的质粒用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase) (D7027)进行去磷酸化处理，电泳后进行DNA回收得到线性化去磷酸化的携带目的基因的pShuttle质粒。
2.共转化到BJ5183菌中产生重组腺病毒质粒
(1)将线性化并去磷酸化的pShuttle质粒与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1（D8106）共转化到BJ5183菌中完成腺病毒质粒的重组。也可以将线性化的质粒转化到已经携带pAdeasy-1质粒的BJ5183细菌(D8107)中直接进行重组。
(2)质粒在BJ5183菌中重组后得到的腺病毒质粒具有卡那霉素抗性，因此需要将转化的菌涂在卡那霉素平板上培养。培养过夜长出的克隆可能会大小不一，正常大小的菌落有可能是没有酶切完全的pShuttle质粒，而重组的腺病毒质粒因为质粒大生长速度慢，所长出的克隆会比较小，挑选较小的克隆10个分别接种到3ml含有卡那霉素的LB中培养过夜。
(3)将少量扩增好的菌用来抽提质粒，然后用Pac I酶切鉴定。重组腺病毒质粒经Pac I酶切后得到一个约30Kb的大片段和一个3Kb或4.5Kb的小片段(重组发生的位置不同导致)
(4)将鉴定正确的重组腺病毒质粒转化到重组酶缺陷型菌株Stbl3(D0378)或者XL10-Gold的超级感受态细菌中进行扩增。扩增所得的重组腺病毒质粒用Pac I酶切，取少量酶切后的质粒跑电泳鉴定。剩余的酶切产物经DNA纯化后用于后续的腺病毒包装,可以选购碧云天的DNA纯化试剂盒(D0033)。
3.腺病毒的包装
(1)接种7-8 X 105的HEK293细胞(C6002)或者Ad-293细胞到60-mm的细胞培养皿(FCD060)中，培养24小时。
(2)第二天将Pac I酶切后的重组腺病毒质粒转染到培养过夜的HEK293细胞或者Ad-293细胞中，推荐使用碧云天的Lipo293™转染试剂(C0521)。
(3)转染6小时后换新鲜细胞培养液继续培养7-10天，中间观察培养液颜色若变黄则换液，换液时需小心，勿将细胞吸出，如果细胞贴壁不牢，则可以换液时小心吸取部分培养液，再补加一定体积的新鲜培养液。7-10天后发现皿中细胞出现大量空斑或者细胞明显漂浮起来则可以收集腺病毒了。
4.收集和扩增腺病毒
(1)将包装腺病毒的细胞培养液小心吸出，勿吸到细胞，加0.5ml的PBS(C0221A/ST476)到细胞皿里，将细胞刮下后转移到1.5ml离心管中。
(2)采用反复冻融的办法裂解细胞，冻融可用干冰，液氮或者-80度冰箱，冻细胞10分钟，取出于37℃融化10分钟，反复冻融四次。
(3)冻融后于4℃ 5000rpm离心10分钟后，取上清即为P0代腺病毒，可用于后续的扩增和纯化，分装后于-80℃保存。
(4)可以用制备的P0代腺病毒感染HEK293细胞或者Ad-293细胞来扩增病毒。将P0代腺病毒加入新鲜HEK293细胞或者Ad-293细胞培养液中进行病毒少量扩增。至细胞再次出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融四次收集病毒，以此病毒为P1 代病毒，以P1 代腺病毒感染HEK293细胞或者Ad-293细胞，连续进行三代感染，至P4 代进行腺病毒的大量扩增，待空斑形成后收集病毒并对病毒进行体外纯化和浓缩。 将扩增的病毒测定滴度后分装于-80℃保存。
构建腺病毒所需试剂耗材