碧云天生产的YO-PRO-1/PI细胞凋亡与坏死检测试剂盒(Apoptosis and Necrosis Detection Kit with YO-PRO-1and PI)，简称YP1/PI细胞凋亡与坏死检测试剂盒，是一种基于DNA绿色荧光染料YO-PRO-1 (YP1)和红色荧光染料碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)的双荧光法检测细胞凋亡和坏死的试剂盒。本试剂盒适用于荧光显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪及其它荧光检测系统。

YO-PRO-1，又名恶唑黄(Oxazole yellow)，简称YP1，是一种对正常动物细胞膜没有通透性而对于凋亡细胞的细胞膜有通透性的DNA绿色荧光染料，常用于细胞凋亡的检测。YO-PRO-1是一种非细胞膜穿透性的并对DNA具有高亲和力的羰花青单体绿色荧光染料，在没有与DNA结合的时候基本上没有荧光，而与DNA结合后可以发出明亮的绿色荧光。在细胞凋亡发生时，细胞膜通透性发生改变，此时YO-PRO-1可以进入细胞内与DNA结合，发出明亮的绿色荧光，因此常使用本荧光染料用于分析和鉴定凋亡细胞。需要注意的是YO-PRO-1也能染色坏死细胞，因此需要和对坏死细胞特异性荧光染色的PI进行双染才能有效判定细胞凋亡。

PI，即碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一种核酸红色荧光染料，只能染色细胞膜完整性丧失的坏死细胞，并与核酸结合发出明亮的红色荧光。因此， YO-PRO-1与碘化丙啶(PI)联合使用，可以同时进行凋亡细胞和坏死细胞的检测，凋亡细胞呈现绿色荧光，坏死细胞同时呈现红色和绿色荧光阳性，活细胞很少或几乎没有荧光。

细胞死亡包括凋亡(apoptosis)、坏死(necrosis)、焦亡(pyroptosis)等多种形式。其中受调控的细胞死亡被称为程序性细胞死亡(programmed cell death, PCD)。程序性细胞死亡包括凋亡、细胞程序性坏死(programmed necrosis)或坏死性凋亡(necroptosis)和焦亡等。从细胞膜的完整性角度来看，凋亡的特征是细胞膜的完整性会保留，而坏死的特征是细胞膜的完整性会丧失。

细胞凋亡是生物体发育等生命过程中普遍存在的、由基因决定的细胞主动有序的死亡方式。当细胞遇到内、外环境因子刺激时，启动基因调控的自杀保护措施，去除体内非必需细胞或即将发生特化的细胞。在这一过程中，细胞脱落离体或裂解为若干凋亡小体，并迅速被巨噬细胞或邻近细胞清除，不会导致炎症反应，这是一种由基因控制、高度有序的细胞自主死亡，包含一系列信号事件组成的通路。细胞凋亡的主要特征包括细胞膜保持完整、细胞膜磷脂酰丝氨酸外翻(Annexin V染色阳性)、基因组DNA片段化(DNA fragmentation) (即产生DNA ladder并且TUNEL染色阳性)、电镜或荧光染色时细胞核碎裂或致密浓染、Caspase 3等激活、线粒体膜电位下降、细胞色素C从线粒体内释放等。

坏死通常被认为是一种偶发性的并且是被动的细胞死亡，如物理性或化学性的损害因素及缺氧与营养不良等都可以导致细胞坏死。坏死细胞初期细胞膜通透性增高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，早期细胞核无明显形态学变化，最后细胞破裂，细胞膜丧失完整性，释放出细胞内容物，并常引起炎症反应，但不会出现细胞凋亡或自噬标志物。通常，凋亡对生命体是有利的，而坏死很可能是有害甚至是致命的。凋亡的晚期也可以发生继发性坏死(secondary necrosis)。受细胞程序性调控的坏死(programmed necrosis)被称为necropotosis。

YO-PRO-1与DNA结合后的最大激发光波长为491nm，最大发射波长为509nm；PI与DNA结合后的最大激发光波长为535nm，最大发射光波长为617nm。YO-PRO-1、PI与DNA结合后的激发光谱和发射光谱参考图1。

图1. YO-PRO-1、PI与DNA结合后的激发光谱和发射光谱。

本试剂盒作为一种细胞凋亡和坏死检测试剂盒，可以应用于大多数的哺乳动物细胞，包括贴壁细胞和悬浮细胞，与传统的Annexin V-FITC/PI检测方法相比，检测准确性和灵敏度相当。本试剂盒用于检测细胞凋亡与细胞坏死的效果参考图2。

图2.YO-PRO-1/PI细胞凋亡与坏死检测试剂盒检测MOLM13 (人急性髓原白血病细胞)细胞凋亡与坏死的效果。正常状态的MOLM13细胞在明场下的形态见图A；正常细胞不会被YO-PRO-1以及PI染色(图B-D)。50μM Camptothecin诱导7小时后的MOLM13细胞在明场下的形态见图E；此时细胞产生明显的凋亡，凋亡细胞的细胞核被YO-PRO-1染色为绿色荧光(图F)；坏死细胞的细胞核则同时被YO-PRO-1和PI染色，红色荧光和绿色荧光重叠呈现橙黄色 (图G)。实际检测效果会因实验条件、检测仪器的不同而存在差异，本图仅供参考。

本试剂盒提供的YO-PRO-1和PI为1000X溶液，使用非常便捷。为了得到比较理想的染色结果，请根据细胞类型和实验实际情况对探针染色液的稀释倍数进行适当调整。YO-PRO-1的工作浓度一般为0.5-5X，推荐使用浓度为1X；PI的工作浓度为0.1-4X，推荐使用浓度为1X。同时，本试剂盒配套提供的检测缓冲液可在一段时间内维持细胞的正常状态， 并给细胞提供一定的营养，效果通常比PBS或HBSS更好。

本试剂盒小包装C1075S和中包装C1075M用于流式细胞仪，每个样品使用0.5ml的检测工作液，可以分别进行100次和500次检测；用于96孔板每孔检测体系的体积为100μl时可以分别可以检测500次和2500次，检测体系体积为200μl时可以分别可以检测250次和1250次。实际检测次数会因为检测体系的大小和所使用底物浓度的高低而有所不同。

-20℃避光保存，至少1年有效。C1075-3检测缓冲液也可4℃保存。

荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

检测缓冲液应在无菌环境中使用，否则可能会被微生物污染而影响使用效果，甚至无法继续使用。

两种荧光探针首次使用时，可以适当分装后在-20℃避光保存，适当避免反复冻融。

YP1和PI对人体有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护以避免直接接触人体或吸入体内。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。