碧云天的Beyo3D™细胞膜绿色荧光染色试剂盒(DiO)，即Beyo3D™ Cell Plasma Membrane Staining Kit with DiO (Green Fluorescence)，是以DiO为荧光探针，并提供了染色增强剂和染色缓冲液，可快速、便捷地用于3D培养的细胞球或类器官细胞膜染色的试剂盒。仅需染色15分钟，就可在荧光显微镜下观察到非常明亮的细胞膜绿色荧光染色。本试剂盒适用于荧光显微镜、荧光酶标仪及其它荧光检测系统。

DiO即DiOC18(3)，全称为3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate，分子式为C53H85ClN2O6，分子量为881.72，CAS号为34215-57-1，是最常用的细胞膜荧光探针之一，呈现绿色荧光。DiO是一种亲脂性羰花青(Carbocyanine)染料，具有很长的亲脂性烃链，进入细胞膜后可以侧向扩散逐渐使整个细胞的细胞膜被染色，染色后非常稳定。

DiO在进入细胞膜之前荧光非常弱，仅当进入到细胞膜后才可以被激发出很强的荧光。DiO被激发后可以发出绿色的荧光，最大激发波长为484nm，最大发射波长为501nm。

DiO被广泛用于正向或逆向的、活的或固定的神经等细胞或组织的示踪剂或长期示踪剂(Long-term tracer)。DiO毒性很低，通常不会影响细胞的生存力(Viability)。DiO对于细胞膜染色的荧光强度通常要低于DiI，有时对于某些经过固定的组织的染色效果欠佳。

本试剂盒提供了染色增强剂，使细胞膜染色更加快速，荧光染色更加明亮，染色背景更低。

本试剂盒可以直接染色活的细胞或组织，染色时间通常为15分钟。对于固定的细胞或组织，通常宜使用配制在PBS中的4%多聚甲醛进行固定，使用其它不适当的固定液会导致荧光背景较高。

本试剂盒适用范围广。本试剂盒可用于常规方法培养出的3D细胞球或类器官，包括超低吸附细胞培养板、Matrix-Gel™基质胶或Matrigel包被的平板、琼脂糖包被的平板、细胞悬滴培养板等。

本试剂盒使用便捷，整个检测过程仅需约15-30分钟即可完成。对于常规的3D细胞活细胞染色，仅需将本试剂盒中的Beyo3D™ DiO (200X)和染色增强剂(400X)按照相应比例用染色缓冲液配制成Beyo3D™ DiO染色工作液，避光孵育15分钟，就可进行后续的荧光显微镜拍照或者荧光酶标仪定量等荧光检测和分析。也可以固定后再使用本产品进行染色。本产品对3D培养的HCT-116细胞的染色效果参考图1。

图1.碧云天Beyo3D™细胞膜绿色荧光染色试剂盒(DiO) (C1419)对于3D培养的HCT-116细胞的染色效果图。5000个HCT-116细胞在使用碧云天3D细胞培养包被试剂盒(U形底96孔板) (C0366)包被的U形底96孔板中培养72小时，吸除培养液后直接加入Beyo3D™ DiO染色工作液，染色15分钟。结果显示，Beyo3D™细胞膜绿色荧光染色试剂盒(DiO)对于3D细胞染色效果清晰、明亮。蓝色荧光采用Beyo3D™ Hoechst 33342染色液(C1345)进行染色。实际检测效果会因细胞株、实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

DiO染色后可以兼容免疫荧光实验。建议使用碧云天的免疫染色通透液(Saponin) (P0095)或使用洋地黄皂苷(Reagent grade) (ST1272)配制的不会溶解细胞膜的通透液进行通透，其它去垢剂配制的通透液可能会溶解细胞膜上的脂类物质，造成DiO失去结合位置，最终导致DiO的染色失效。但通透也可能会影响DiO在细胞膜上的定位并会增加细胞内的染色，具体实验中需根据实验的需求选择合适的细胞通透液。

传统的细胞培养大多以二维(Two-dimensional, 2D)的形式展开，但2D培养的细胞在生长方式、生长形态、分化和功能等方面都与体内生理条件下细胞的真实形态和结构存在明显差异，可能会因为细胞结构和组织形态的缺失，使实验结果的可信度降低[1-3]。三维(Three-dimensional, 3D)细胞培养能够更好地模拟体内细胞生存的微环境，更能代表体内组织，也能更真实的反应细胞与细胞间、细胞与基质间的相互作用，细胞对外源性和内源性刺激的应答也更接近于它们在体内的反应，3D细胞培养从而成为更有价值并更为可信的体外实验模型，能够获得与体内实验更加一致的实验结果[4-5]。

3D肿瘤细胞模型越来越多地被用于了解疾病机制和药物研发。2D培养的肿瘤细胞，其单侧细胞膜可以均匀地获得营养和氧气，而3D培养的肿瘤细胞团的内部细胞获得营养和氧气的机会更少，形成自然的营养和氧气梯度，能更好地模拟体内微环境条件，因此3D培养的肿瘤球状体(Spheroid)或肿瘤类器官(Organoid)等能更好地模拟体内肿瘤，更利于小分子药物筛选或者肿瘤相关分子机制的研究，也更能准确地预测药物治疗的体内反应、疗效或毒性。同时，2D肿瘤细胞模型体外扩增有一定局限性，在传代后容易丧失原肿瘤的遗传异质性，出现优势克隆选择性，从而降低临床相关性。相比于2D细胞模型，3D细胞球或者类器官很多情况下能提供更可信的研究结果，简化并加速药物评价流程。自2009年小肠类器官首次建立至今，3D细胞和类器官研究已经扩展到很多组织系统，并成为生命科学最热门的领域之一。

按照96孔板每孔需要100μl Beyo3D™ DiO染色工作液，本试剂盒小包装和中包装分别可以进行100个和500个样品的检测。

-20ºC保存，一年有效。Beyo3D™ DiO (200X)须避光保存。染色增强剂(400X)和染色缓冲液也可短期4ºC保存。

细胞球在外力的作用下容易变形或分散，固定、PBS洗涤及换液等过程须轻缓，避免破坏或吹散3D细胞球。

如果染色时间过长或染色后细胞继续培养，探针也可能进入细胞内而染色其它细胞器的膜。

染色缓冲液经过过滤除菌处理，在使用时须注意避免微生物污染，否则很可能严重影响染色效果。如果染色缓冲液发生浑浊等明显的微生物污染，就不能继续使用。

荧光物质均易发生淬灭，在进行荧光观察时，尽量缩短观察时间，同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。