碧云天研发的β-Secretase 1 (BACE1)抑制剂筛选试剂盒(BACE1 Inhibitor Screening Kit)是一种用荧光法简单、快速、高通量、高灵敏地筛选β-Secretase 1抑制剂的试剂盒。本试剂盒不仅适合少量样本的检测，也非常适合高通量筛选(High-throughput screening)的自动化操作系统。

β-Secretase 1 (β-分泌酶1)，也称为β位淀粉样前体蛋白裂解酶1、β位APP裂解酶1 (Beta-site APP cleaving enzyme 1, 简称BACE1)、膜相关天冬氨酸蛋白酶2 (Membrane-associated aspartic protease 2)、Memapsin-2、天冬氨酰蛋白酶2 (Aspartyl protease 2, 简称ASP2)。BACE1是一种天冬氨酸蛋白酶，在多种人体组织中表达，可以切割淀粉样蛋白前体蛋白(Amyloid precursor protein, APP)产生40或42个氨基酸的β-淀粉样蛋白肽(Amyloid-β peptide)。阿尔茨海默氏症(Alzheimer's disease)，俗称早老性痴呆、老年痴呆，是一种发病进程缓慢、随着时间不断恶化的神经退化性疾病，会导致脑萎缩和脑细胞死亡。阿尔茨海默氏症患者大脑中β-淀粉样蛋白肽在斑块和血管壁的沉积被普遍认为是导致该疾病的主要因素[1]。实验表明抑制BACE1活性可以有效减少β-淀粉样蛋白肽的产生，因此筛选BACE1抑制剂作为治疗阿尔茨海默病的药物成为热门治疗靶标[2-5]。

β-Secretase 1 (BACE1)抑制剂筛选试剂盒采用荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方法，其检测原理如下。MCA是荧光供体(Donor)，Dnp是荧光受体(Acceptor)或称为淬灭基团(Quencher)，这两个荧光基团的吸收光谱有一定的重叠，当这两个荧光基团间的距离合适时(一般7-10nm)，荧光能量由供体向受体转移，导致供体荧光分子自身的荧光强度衰减。MCA和Dnp被连接到BACE1蛋白酶的底物(Substrate)的两端。当BACE1没有切割底物时，两个基团足够接近，发生荧光共振能量转移，即Dnp可淬灭MCA的荧光而导致检测不到荧光；当该底物被BACE1切割后，多肽的首尾两端分离，两个基团分开，MCA的荧光不再被Dnp淬灭，即可检测到MCA的荧光，这样通过荧光检测就可以非常灵敏地检测BACE1蛋白酶的酶活性。如果在反应体系中加入BACE1的抑制剂(Inhibitor)，荧光的生成会被抑制，荧光强度与抑制剂的抑制效果成反比，这样就可以检测出BACE1蛋白酶抑制剂的抑制效果。MCA的最大激发波长为325nm，最大发射波长为393nm。

图1.碧云天β-Secretase 1 (BACE1)抑制剂筛选试剂盒(P0363)检测原理图。

本试剂盒抑制剂筛选结果更加真实可信。本试剂盒中使用的BACE1 Enzyme是采用HEK293真核细胞表达human BACE1 (Swiss-Prot:P56817)胞外的酶活性区域(Glu46-Thr457)，含有天然BACE1全部4个N-glycosylation糖基化修饰(Asn153, Asn172, Asn223和Asn354)，与天然BACE1相比在结构和功能方面相同，因此采用本试剂盒筛选获得的BACE1抑制剂更加真实有效。

本试剂盒兼容性强。常用溶剂如DMSO、无水乙醇、甘油等对本试剂盒的检测结果影响较小，实测反应体系中DMSO、无水乙醇或甘油含量达5%时，孵育1小时的信号下降分别不超过20%、8%和10%。去垢剂如Triton X-100等的含量在0.5%时孵育1小时的信号下降不超过25%。检测时通过设置溶剂对照，可以有效消除溶剂对于检测体系的影响。

本试剂盒信号佳。本试剂盒在孵育1小时时，100%酶活性信号约为背景信号的50倍，确保有足够的信号范围用于抑制剂的筛选。通常在孵育2小时内，信号与孵育时间成正比，2小时后即趋于稳定。

本试剂盒提供了BACE1酶(BACE1 Enzyme)、底物(BACE1 Substrate)、阳性对照抑制剂(Verubecestat (MK-8931))。底物为MCA-EIDLMVLDK(Dnp)，BACE1酶剪切该底物的速率比常见的Swedish variant多肽(EVNLDAEF)快约13倍[6]，因此该底物更适合用于BACE1的抑制剂筛选。本试剂盒对BACE1酶和底物的使用量进行了优化，不仅能检测出IC₅₀很低的抑制剂，也能检测出IC₅₀较高的抑制剂。本试剂盒提供的阳性对照Verubecestat (MK-8931)是一种高效、选择性的BACE1/2抑制剂，经本试剂盒检测的IC₅₀约为32nM，实测数据会略有偏差。本试剂盒检测Verubecestat (MK-8931)的效果请参考图2。

图2.碧云天β-Secretase 1 (BACE1)抑制剂筛选试剂盒(P0363)检测BACE1抑制剂MK-8931的效果图。实际检测结果可能会因样品和检测条件等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

使用96孔板检测时，本试剂盒小包装可以进行100次检测，中包装可以进行500次检测。

-20℃保存，一年有效。其中BACE1 Substrate (20X)需避光保存。为取得更理想的检测效果，BACE1 Enzyme推荐在-80℃保存更佳。

由于BACE1 Enzyme每次冻融均会引起部分失活，建议分装后放入-80℃保存，尽量避免反复冻融。

Assay Buffer、BACE1 Substrate、MK-8931需完全解冻并平衡至室温后再使用，否则会影响检测结果。BACE1 Enzyme在使用时应置于冰上。使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。

待测抑制剂样品的溶剂可能会对检测产生干扰，推荐使用本试剂盒提供的Assay Buffer作为溶剂用于配制、稀释样品。如果样品必须用其它试剂配制、稀释，请进行一定的测试，并添加与样品等量的溶剂作为100%酶活性对照。

体积较小的试剂首次使用时建议先离心数秒使液体沉降于管底，然后再使用。结冻的试剂必须完全融化并混匀后使用。

检测时建议使用96孔黑板，推荐选购碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。