碧云天生产的Bio-Lumi™ Steady II萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(Bio-Lumi™ Steady II Firefly Luciferase Reporter Gene Assay Kit，Bio-Lumi™ Steady II Firefly Luciferase Assay Kit)，简称Bio-Lumi Steady II，是一种高灵敏度、高信号稳定性的通过化学发光法检测 ADCC Reporter Bioassay或细胞中萤火虫萤光素酶(firefly luciferase)报告基因的表达的试剂盒。本产品和同类产品相比，最大的特点是发光信号特别稳定，1小时内信号整体上下波动范围通常不超过±20%，特别适用于待测样品数量较多、耗时较长且须前后数据进行比较的多孔板中萤火虫萤光素酶的大批量连续测定，也特别适用于高通量筛选(high-throughput screening)的自动化操作系统。

本产品是Bio-Lumi™ Steady萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(简称Bio-Lumi Steady，产品编号为RG046)的不同包装版本，两者的检测效果完全一致。Bio-Lumi Steady为即用型液体，其优点是无需配制即可以直接使用，缺点是需要-80ºC保存，如果在-20ºC保存时间较长后检测效果会逐渐下降；本产品，即Bio-Lumi Steady II，为Bio-Lumi Steady的冻干粉版本，使用前需要使用提供的缓冲液充分溶解底物冻干粉后才能使用，优点是在-20ºC保存非常稳定。

本产品使用了一种新的萤光素酶底物，因此与标准的萤光素酶分析试剂相比，本产品与样品的反应更稳定、对样品组分的耐受性更强。本产品不易受到混合和加样条件的影响，从而增强了结果的可重复性，是ADCC (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, 抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用) Reporter Bioassay及其它萤火虫荧光素酶报告基因活性检测的理想选择。

本产品的用途与碧云天的同类产品Bio-Lumi™萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(简称Bio-Lumi)、Bio-Lumi™ One萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(简称Bio-Lumi One)及Vazyme公司的 Bio-Lite Luciferase Assay System(简称Bio-Lite)、Promega公司的Bio-Glo™ Luciferase Assay System (简称Bio-Glo)类似。本产品的发光强度稍弱于同类产品 (图1A)，但是化学发光信号的稳定性显著优于Bio-Lumi、Bio-Lumi One、国内同类产品(Competitor V及国外同类产品(Competitor P) (图1B)。本产品与Bio-Lumi、Bio-Lumi One及国内同类产品(Competitor V)、国外同类产品(Competitor P)的检测效果比较参见图1。

图1. 碧云天Bio-Lumi™ Steady II萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(Bio-Lumi Steady II) (RG047)和同类产品Bio-Lumi™萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(Bio-Lumi) (RG042)、Bio-Lumi™ One萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(Bio-Lumi One) (RG044)及国内同类产品(Competitor V)、国外同类产品(Competitor P)对转染阳性萤火虫萤光素酶报告基因质粒的HeLa细胞的检测效果。Bio-Lumi Steady II与碧云天生产的Bio-Lumi™ Steady萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(Bio-Lumi Steady)的检测效果完全一致。图A为Bio-Lumi Steady即Bio-Lumi Steady II和Bio-Lumi、Bio-Lumi One、Competitor V、Competitor P的化学发光强度的检测效果对比图，图B为Bio-Lumi Steady即Bio-Lumi Steady II和Bio-Lumi、Bio-Lumi One、Competitor V、Competitor P的化学发光稳定性的检测效果对比图。实际读数会因细胞种类、所用萤火虫萤光素酶表达体系、转染效率、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本产品发光信号特别稳定。本产品的发光信号稳定性特别好，在反应30分钟内信号波动不超过15%，反应60分钟内信号波动不超过25%，信号半衰期可以达到2小时，在发光稳定性方面显著优于同类产品(图1B)，特别适用于待测样品数量较多的96孔板或384孔板中萤火虫萤光素酶活性的大批量连续测定。发光信号的稳定性可能会因为细胞种类、外界温度等条件的不同而略有差异。

本产品发光强度高。对于相同的细胞样品，本产品的发光效果可以达到Bio-Lumi的约40-60%，达到Bio-Lumi One的约60-80%，达到国内同类产品(Competitor V)的约50-70%，达到国外同类产品(Competitor P)的约65-75%(图1A)，实测效果可能会因细胞种类、检测环境等的不同有所差异。如果样品中萤火虫萤光素酶的表达水平非常低时，推荐使用灵敏度更高的Bio-Lumi™ 萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG042)或Bio-Lumi™ One萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG044)。

本产品的检测灵敏度高，测定样品的线性范围宽。96孔板中，通常本产品可以在20万个细胞范围内呈现良好的线性关系。不同的细胞、不同的萤光素酶表达水平的检测细胞数量的上限可能有所差异，当萤火虫萤光素酶表达水平很高时，可能只在10万个细胞范围有良好的线性关系，但是化学发光读数还是会随着细胞数量的增加而继续升高的。本产品对转染萤火虫萤光素酶报告基因质粒的不同数量的HeLa细胞的检测效果参见图2。

图2. 碧云天Bio-Lumi™ Steady II萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒(RG047)对转染萤火虫萤光素酶报告基因质粒的不同数量的HeLa细胞的检测效果。根据共转的EGFP表达质粒，实测转染效率约为60-70%。实际读数会因细胞种类、转染效率、所用报告基因质粒、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

本产品操作简单，读数稳定，检测速度快，完成检测仅需约10分钟。本产品比其它萤光素酶测定方法更加简单快捷，细胞可以在同一块多孔板中培养和检测，无需洗涤细胞，也无需更换或去除培养液，只需用试剂盒提供的检测缓冲液把检测底物(冻干粉)充分溶解后配制成Bio-Lumi™ Steady II萤火虫萤光素酶检测试剂与培养的细胞等体积混合，反应5分钟后即可进行化学发光检测。并且产生的化学发光信号特别稳定，信号半衰期长达2小时。使用可以测定96孔板的化学发光的多功能酶标仪通常在2分钟内就可以完成一块96孔板的检测。

本产品稳定性好。本产品在-20ºC可以长期保存，配制成Bio-Lumi™ Steady II萤火虫萤光素酶检测试剂的稳定性非常好，反复冻融5次检测效果下降不超过5%，反复冻融10次检测效果下降不超过15%。本产品在4ºC条件下保存3天检测效果下降不到25%，保存5天检测效果下降不超过35%，保存7天仍可保留60%以上的检测效果。在室温保存1天可保留70%以上的检测效果，室温保存3天可保留50%以上的检测效果，在37ºC保存1天可保留50%以上的检测效果。本产品即使仅保留约50%的检测效果，仍可以满足各种常规检测。

本产品使用灵活便捷。本产品不仅适合少量样品的检测，也非常适合大量样品的高通量检测(high-throughput screening)。本产品不仅可以等体积加入到细胞培养孔中进行直接检测，也可以先使用RG126S/M萤火虫萤光素酶报告基因细胞裂解液裂解或者RG127S/M萤火虫萤光素酶报告基因细胞裂解液(增强型)裂解并收集细胞后再用本产品进行检测。

本产品兼容性强。本产品兼容各种常见培养液，正常培养液中的酚红、10%以内的胎牛血清或小牛血清、2%以内的DMSO或乙醇、萤光素酶抑制剂等对信号和稳定性基本没有影响，常用的盐类或金属离子在正常浓度下也基本没有影响。

萤火虫萤光素酶(firefly luciferase)是一种分子量约为61kD的蛋白，在ATP、镁离子和氧气存在的条件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出波长为560nm左右的生物萤光(bioluminescence)。生物萤光可以通过化学发光仪(luminometer)或液闪测定仪进行测定。通过萤光素和萤光素酶这一生物发光体系，可以非常灵敏、高效地检测基因的表达[1-2]。通常把感兴趣基因的转录调控元件或5’启动子区克隆在luciferase的上游，或把3’-UTR区克隆在luciferase的下游等，构建成报告基因(reporter gene)质粒，然后转染细胞，用适当药物等处理细胞后裂解细胞，测定萤光素酶活性，通过萤光素酶活性的高低来判断药物等处理对目的基因的转录调控作用。在ADCC Reporter Bioassay中，ADCC效应细胞(ADCC bioassay effector cells)通过改造可稳定表达由NFAT (nuclear factor of activated T-cells)应答元件驱动的萤火虫萤光素酶表达系统以及Fc受体(如FcγRIIIa receptor)。当抗体的Fab片段与靶细胞(target cells)上的相应抗原表位特异性结合时，抗体的Fc片段与效应细胞的Fc受体结合，从而激活NFAT信号通路，并诱导萤火虫萤光素酶的表达，通过加入Bio-Lumi™试剂并使用发光检测仪来定量检测萤火虫萤光素酶的表达[3]。本试剂盒的萤火虫萤光素酶检测原理参考图3。

图3. 萤火虫萤光素酶的检测原理图。

碧云天的三款一步法Bio-Lumi萤火虫萤光素酶报告基因检测试剂盒的主要特点和差异如下。如果希望发光信号比较强，并在30分钟内即可进行检测，推荐使用Bio-Lumi；如果对信号稳定性要求特别高，需要批量或连续操作，推荐使用Bio-Lumi Steady；如果对发光信号和稳定性都有要求，推荐使用Bio-Lumi One。

关于碧云天萤光素酶报告基因检测试剂盒相关产品的比较和选择，请参考碧云天的相关网页：

http://www.beyotime.com/support/luciferase-reporter-gene-assay.htm

萤光素、萤光素酶、萤火虫萤光素酶和海肾萤光素酶也经常被称作荧光素、荧光素酶、萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。

对于96孔板，推荐使用100μl细胞培养液和100μl的检测试剂，总体积为200μl，此时本试剂盒每10ml可以进行100次检测。对于384孔板，推荐使用25μl细胞培养液和25μl的检测试剂，总体积为50μl，此时本试剂盒每10ml可以进行400次检测。也可以用其它体积的试剂进行检测，但细胞培养液和检测试剂体积的比例须为1:1。虽然我们有检测数据显示适当减少检测试剂的用量很可能仍然会得到较好的检测结果，但对于细胞数量偏多、细胞数量特别少或者重复性要求比较高的情况，建议按照推荐用量进行检测。

-20ºC避光保存，至少一年有效。检测缓冲液和检测底物混合后配制成的Bio-Lumi™ Steady II萤火虫萤光素酶检测试剂，-80ºC避光保存，至少一年有效；-20ºC避光保存，推荐3-6个月内使用。

对于订购后可能放置较长时间后再使用的，或者对于检测结果的精度要求特别高的，推荐订购Bio-Lumi™ Steady II；对于订购后短期内使用完毕的，推荐订购使用更加便捷的Bio-Lumi Steady。

由于萤光素酶的活性对温度比较敏感，所以反应前细胞和检测试剂均需达到室温后再进行测定。可将检测缓冲液在室温或不超过25°C的水浴中融解并混匀后再与检测底物混合成检测试剂使用。

尽管经测试检测缓冲液和检测底物混合后配制成的Bio-Lumi Steady II萤火虫萤光素酶检测试剂反复冻融5次对于其检测效果无显著影响，为保证检测试剂的稳定性、取得良好的使用效果，建议现用现配。没有用完的检测试剂可以采取适当分装后避光保存的方法，以避免反复冻融和长时间暴露于室温。反复冻融过程中，可能会导致检测试剂中出现少量沉淀，此时宜平衡至室温，并尽量溶解。如仍有残留的不溶物，可以离心去除后使用，经测试不会影响后续的检测效果。

请使用适合于细胞培养的白色或黑色的96孔板或384孔板。如果使用普通透明的96孔板或384孔板，相邻孔之间会产生相互干扰。推荐使用碧云天的BeyoGold™全黑或全白96/384孔细胞培养板(FCP966/FCP968/FCP983/FCP985)、白色或黑色透明底96/384孔细胞培养板(FCP963/FCP965/FCP986/FCP987)。

待测药物的溶剂含量较高时可能会干扰萤光素酶反应，从而影响化学发光信号。可以通过设置含有溶剂的细胞培养液对照孔排除溶剂的干扰。经测试，最终反应体系中DMSO含量在2%以内不会对反应产生影响。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。