快速DNA连接试剂盒

 产品编号: D7003
 产品包装: 500次
 产品价格: 666.00元
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产品简介

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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D7003 快速DNA连接试剂盒 500次 666.00元

    快速DNA连接试剂盒(Rapid DNA Ligation Kit) 是碧云天研发的一种把DNA片段在短至5-10分钟内快速插入到载体(vector)中的连接试剂盒。对于双粘端DNA片段的插入仅需5-10分钟即可完成,对于双平端DNA片段的插入仅需15分钟即可完成。同时本试剂盒也可以用于其它各种常规的双链DNA连接反应。连接30分钟即可达到最佳效果,与连接过夜的效果一致。
    本试剂盒可以用于PCR片段和载体的连接、酶切产物和载体的连接、linker和载体的连接、linker和linker的连接等各种双链DNA的连接。
    为了获得快速高效的连接效果,本试剂盒采用了一种特殊的高活力Rapid T4 DNA Ligase以及相应的快速连接缓冲液,确保在短时间内可以获得很好的连接效果。连接30分钟和连接过夜的效果相当,通常只须连接5-10分钟即可满足常规用途(图1)。


    图1.快速DNA连接试剂盒实测效果图。双酶切后的载体室温自连30min(A)或16℃自连过夜(D)作为阴性对照;双酶切后的载体与待插入片段室温连接10min(B)、30min(C)或者16oC连接过夜(E),随后转化细菌涂板,并于第二天取平板观察拍照。

    在确保连接效果的同时,确保完成连接后不必进行任何纯化即可直接转化细菌。另外,快速连接缓冲液中已经含有ATP、镁离子等各种必需物质,无需再添加其它任何试剂。
    本试剂盒用于总体积为10μl的连接体系时可以进行500个连接反应,用于总体积为20μl的连接体系时可进行250个连接反应。
包装清单:

产品编号

产品名称

包装

D7003-1

快速连接缓冲液(2X)

0.5ml0.5ml/管, 共5管

D7003-2

Rapid T4 DNA ligase

250μl

说明书

1份

保存条件:
    -20℃保存。
注意事项:
    连接反应完成后即可直接转化细菌,请勿采用加热方法失活Rapid T4 DNA ligase。加热处理会导致后续的转化效率显著下降。
    对于载体单酶切插入外源片段的情况,需注意对载体进行脱磷处理,以避免质粒自连。
    快速连接缓冲液(2X)使用前一定要完全溶解并混匀,加入到连接体系后也须注意混匀。
    本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
    为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明

使用说明:
1. PCR产物或酶切片段和普通载体的连接:
   a. 取1-2μg载体酶切过夜,或至少酶切3-5小时以上。尽量确保酶切充分,否则后续会导致产生很多
      自连的克隆。
   b. 载体酶切完毕后,可以使用试剂盒进行纯化,例如碧云天的PCR纯化试剂盒/DNA纯化试剂盒
      (D0033)
。也可以采用常规的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法纯化载体。对于酶切产生较大片段(大于50-
      60bp)的情况推荐采用切胶回收的方式。
   c. 对于PCR产物:PCR产物凝胶电泳后,切胶回收预期大小的DNA片段。凝胶中DNA片段的回收可以使
      用试剂盒进行操作,例如碧云天的DNA凝胶回收试剂盒(D0056)。也可以采用反复冻融等方法回收
      DNA片段。
   d. 对于回收的PCR产物或其它需酶切的质粒或DNA片段,用适当内切酶酶切,随后纯化酶切产物。
      注:这一步的酶切不必酶切特别充分,通常酶切效率能达到80-90%以上即可。即本步骤的酶切
      通常酶切1-2小时即可。酶切产物可以使用试剂盒进行纯化,例如碧云天的PCR纯化试剂盒/DNA纯
      化试剂盒(D0033)
。也可以采用常规的酚氯仿抽提乙醇沉淀方法纯化载体。
   e. 取约25-100ng经过酶切和纯化的载体,加入3倍摩尔数的待插入片段。参考下表设置连接反应体
      系。
      注:很多时候由于载体量和待插入片段的量都比较少,在回收后很难定量。此时可以根据回收前
      电泳条带的亮度进行大致的估计。通常以DNA分子量标准的某一条带为参考,估计或通过灰度半定
      量您的目的条带和该参考条带的亮度的比例关系。然后再按照预计的纯化或凝胶回收时的得率计
      算出最终得到的载体量和待插入片段量的比例关系。

载体

约25-50ng

约50-100ng

待插入片段

约载体摩尔数的3倍

约载体摩尔数的3倍

快速连接缓冲液(2X)

5μl

10μl

双蒸水或MilliQ水

至9.5μl

至19μl

Rapid T4 DNA ligase

0.5μl

1μl

总体积

10μl

20μl

   f. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀,室温离心数秒,使液体积聚于管底。
   g. 室温(25℃)孵育连接5-10分钟或更长时间。对于双平端连接需室温(25℃)孵育15-30分钟或更长时
      间。
      注1:对于双粘端连接:室温孵育5-10分钟通常可以达到孵育更长时间所能达到最佳连接效率的
      70%以上。室温孵育60分钟和16℃孵育过夜相比,无显著差异。连接5-10分钟后,如果转化等后续
      步骤还没有准备好,完全可以适当延长连接时间。但通常不宜超过60分钟。如果可能超过60分
      钟,可以在4℃或16℃放置较长时间甚至过夜。
      注2:对于双平端连接:室温孵育15分钟通常可以达到孵育更长时间所能达到最佳连接效率的
      70%以上。室温孵育60分钟和16℃孵育过夜相比,无显著差异。连接15分钟后,如果转化等后
      续步骤还没有准备好,完全可以适当延长连接时间。但通常不宜超过60分钟。如果可能超过60分
      钟,可以在4℃或16℃放置较长时间甚至过夜。
      注3:上述室温连接效率的数据在25℃时获得,在20-27℃时获得的连接效率比较接近。室温较低
      或较高时推荐在25℃水浴进行连接。
   h. 随后即可直接取连接产物用于转化感受态细菌。
2. PCR产物和T载体的连接:
   a. PCR产物凝胶电泳后,切胶回收预期大小的DNA片段。凝胶中DNA片段的回收可以使用试剂盒进行操
      作,例如碧云天的DNA凝胶回收试剂盒(D0056)。也可以采用反复冻融等方法回收DNA片段。
   b. 按照T载体的说明书取适量T载体,加入3倍摩尔数的待插入片段。参考下表设置连接反应体系。
      注:很多时候由于载体量和PCR产物的量都比较少,在回收后很难定量。此时可以根据回收前电
      泳条带的亮度进行大致的估计。通常以DNA分子量标准的某一条带为参考,估计或通过灰度半定量
      您的目的条带和该参考条带的亮度的比例关系。然后再按照预计的纯化或凝胶回收时的得率计算
      出最终得到的载体量和PCR产物的量的比例关系。

T载体

适量

适量

待插入片段

约载体摩尔数的3倍

约载体摩尔数的3倍

快速连接缓冲液(2X)

5μl

10μl

双蒸水或MilliQ水

至9.5μl

至19μl

Rapid T4 DNA ligase

0.5μl

1μl

总体积

10μl

20μl

   c. 用移液器轻轻吹打混匀或轻微Vortex混匀,室温离心数秒,使液体积聚于管底。
   d. 室温孵育5-10分钟或更长时间。
      注:室温孵育5-10分钟通常可以达到孵育更长时间所能达到最佳连接效率的70%以上。室温孵育
      30分钟和16℃孵育过夜相比,无显著差异。连接5-10分钟后,如果转化等后续步骤还没有准备
      好,完全可以适当延长室温的连接时间。但通常不宜超过60分钟。如果可能超过60分钟,可以在
      4℃或16℃放置较长时间甚至过夜。
   e. 随后即可直接取连接产物用于转化感受态细菌。
3. Linker或RNAi片段和载体的连接:
   a. 载体的酶切和纯化同步骤1a和1b。
   b. Linker或RNAi片段的退火可以选择适当的DNA退火缓冲液,例如碧云天的Annealing Buffer for
      DNA Oligos(5X)(D0251)
, 进行退火反应。
   c. 长度大于8bp的Linker或退火的RNAi片段,可以按照5:1至10:1的比例和载体进行连接反应。例如
      载体为0.03pmol,则插入片段可以为0.15至0.3pmol。长度小于8bp的linker,比例需调整为10:1
      以上。
   d. 除插入片段的用量外,随后按照步骤1e-1h进行。
4. DNA自身环化的连接:
   参考步骤1e,待插入片段换成适量的水即可。其余步骤按照步骤1f,1g,和1h进行。
5. 其它类型的DNA片段连接参考上述方法进行。

常见问题:
1. 连接反应后转化效率很低或阳性克隆非常少:
   a. 可能在加入快速连接缓冲液(2X)后没有充分混匀。
   b. 可以尝试提高载体或插入片段的纯度。对于平端连接需注意适当延长连接时间。
   c. 可能载体酶切不够充分,用未经连接的载体转化作为阴性对照。
   d. 用存放DNA的溶液进行转化,作为阴性对照,检测感受态细菌是否存在问题。

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使用本产品的文献:
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   Identification and functional characterization of two orphan G-protein-coupled receptors
   foradipokinetic hormones from silkworm Bombyx mori.

   J Biol Chem. 2011 Dec 9;286(49):42390-402.
2. Yang J, Huang H, Yang H, He X, Jiang X, Shi Y, Alatangaole D, Shi L, Zhou N.
   Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide
   corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling
   cascades.

   J Biol Chem. 2013 Apr 26;288(17):11662-75. doi: 10.1074/jbc.M112.441675.
3. Deng X, Yang H, He X, Liao Y, Zheng C, Zhou Q, Zhu C, Zhang G, Gao J, Zhou N.
   Activation of Bombyx neuropeptide G protein-coupled receptor A4 via a Gαi-dependent
   signaling pathway by direct interaction with neuropeptide F from silkworm, Bombyx mori.

   Insect Biochem Mol Biol. 2014 Feb;45:77-88. doi: 10.1016/j.ibmb.2013.12.007.
   Epub 2013 Dec 27.
4. Chen X, Zheng C, Qian J, Sutton SW, Wang Z, Lv J, Liu C, Zhou N.
   Involvement of β-arrestin-2 and clathrin in agonist-mediated internalization of the
   human cannabinoid CB2 receptor.

   Curr Mol Pharmacol. 2014;7(1):67-80.
5. Yang W, X Dai, M Liu.
   Development of an Indirect Competitive Enzyme-linked Immunosorbent Assays Method Based on
   Immunomagetic-bead for Analyzing Listeria monocytogenes in Food.

   Am J Food Technol. 2016;11(3):100-107.




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