碧云天研发生产的BeyoES™人多能干细胞培养液，即BeyoES™ Human Pluripotent Stem Cell Medium，也称BeyoES™人胚胎干细胞培养液(BeyoES™ Human Embryonic Stem Cell Medium)，是一种配方独特、化学成分明确、专用于无饲养层培养体系下的人类诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cells, iPSCs)或人类胚胎干细胞(Human embryonic stem cell)的无血清培养液。

本产品有助于干细胞克隆的快速形成和扩展(Colony formation and expansion)。经实测，人胚胎干细胞H9在Vitronectin包被并使用本产品培养的条件下，连续传代50次后其自我更新能力(Self-renewal)和未分化状态无改变。

本产品的主要组分类似于同类产品Essential 8™培养液(Gibco, A1517001)和mTeSR™1 (STEMCELL, 85850)，均含有bFGF、TGFβ、维生素C、胰岛素、转铁蛋白、硒等[1]。

本产品可避免使用成分不明确的动物细胞外基质提取物Matrigel、Geltrex或碧云天的Matrix-Gel™基质胶(C0371/C0372/C0376/C0383/C0387/C0392/C0396)。

本产品和BeyoEmbryo™ Human Vitronectin (C0318/C0319)联合使用有非常好的培养效果，可大幅降低培养成本。

本产品在使用碧云天的BeyoEmbryo™ Human Vitronectin (C0318/C0319)包被的情况下，培养的人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞的克隆形态如图1所示。

图1.在使用碧云天的BeyoEmbryo™ Human Vitronectin (C0318/C0319)包被的条件下，碧云天的BeyoES™人多能干细胞培养液(C0800)对于人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞的培养效果图。本产品培养的hES和hiPSCs均能在Day2形成边缘清晰、锐利的克隆，在Day3克隆直径增大到1mm左右，呈现内部细胞排列紧实(Compact)、表面平滑的胚胎干细胞克隆或诱导多能干细胞克隆形态。Day3后细胞增殖的减缓，同时会伴随正常的小部分细胞凋亡。上述形态学特征和增殖速率的动态变化与文献描述基本一致[3]。根据图中检测结果，与国外知名品牌Competitor G的同类产品相比，本产品实测对上述三种人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞的培养效果均显著优于国外同类品牌产品。实际检测效果会因实验条件等的不同而存在差异，本图仅供参考。

本产品在使用基质胶，例如碧云天的Matrix-Gel™基质胶(C0371/C0372)的情况下，同样能取得非常理想的培养效果。本产品在使用碧云天的Matrix-Gel™时培养的人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞的克隆形态如图2所示。

图2.在碧云天Matrix-Gel™基质胶(C0371/C0372)包被条件下，碧云天的BeyoES™人多能干细胞培养液(C0800)对于人胚胎干细胞和人诱导多能干细胞的培养效果图。如图所示，本产品培养的hES和hiPSCs均能在Day2形成边缘清晰、锐利的克隆，在Day3克隆直径增大到1mm左右，呈现内部细胞排列紧实(Compact)、表面平滑的胚胎干细胞克隆或诱导多能干细胞克隆形态。Day3后细胞增殖的减缓，同时会伴随正常的小部分细胞凋亡。上述形态学特征和增殖速率的动态变化与文献描述基本一致[3]。根据图中检测结果，与国外知名品牌Competitor G和国内某品牌Competitor S同类产品相比，本产品实测对上述人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞的培养效果相近或更优。实际检测效果会因实验条件等的不同而存在差异，本图仅供参考。

本产品在使用碧云天的BeyoEmbryo™ Human Vitronectin (C0318/C0319)包被的情况下，在短期培养(连续传代20次以内)时对多能干细胞未分化状态的维持效果如图3所示。图中可见，在该培养条件下，培养5代时多能干细胞蛋白标志物SOX2、TRA-1-81和OCT4免疫荧光检测和碱性磷酸酶染色都呈现强阳性；而干细胞分化标志物SSEA1免疫荧光检测阴性。连续传代到10和20次后，干细胞未分化特征性基因OCT4在P5，P10和P20不同代次中均稳定维持较高的水平。同样，反应干细胞已经分化的特征性基因SOX17，hT(Brachyury)和SOX1的mRNA水平维持极低水平，且在这些代次间无显著差异，提示细胞处于未分化状态。

图3.使用碧云天的BeyoES™人多能干细胞培养液(C0800)并使用碧云天的BeyoEmbryo™ Human Vitronectin (C0318/C0319)包被的情况下能很好维持人胚胎干细胞(hES H9)的未分化状态。图A，使用碧云天多能干细胞免疫荧光检测试剂盒(C3266, C3279, C32613, C3272)分别检测连续传代五次后的多能干细胞，结果显示干细胞多能性蛋白标志物SOX2、TRA-1-81和OCT4呈现正常的强阳性，而分化标志物SSEA1则未检测到表达。图B，使用碧云天多能干细胞碱性磷酸酶显色试剂盒(C3250)检测显示高水平的碱性磷酸酶活性，提示为未分化状态。图C，qRT-PCR分析显示多能干细胞未分化特征基因OCT4，以及内胚层(SOX17)、中胚层(hT(Brachyury))和外胚层(SOX1)分化基因在不同培养代次之间的无显著差异。mRNA水平的上述检测结果提示本产品可稳定维持多能干细胞的未分化状态。实际检测效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

本产品在使用碧云天的BeyoEmbryo™ Human Vitronectin (C0318/C0319)包被的情况下，至少培养5代后仍具有多能干细胞的三胚层分化潜能(图4)。

图4.使用碧云天的BeyoES™人多能干细胞培养液(C0800)并使用碧云天的BeyoEmbryo™ Human Vitronectin (C0318/C0319)包被的情况下，培养5代后的人胚胎干细胞(hES H9)仍具有三胚层分化潜能。图A, H9克隆制备为单细胞后(0 day post differentiation, 0dpd)，自发分化形成拟胚体(3dpd和5dpd)，并在6dpd接种到BeyoEmbryo™ 0.1%明胶溶液(C0316)包被下培养24小时(7dpd)后形态学特征。图B，RT-PCR结合电泳检测7dpd时早期分化基因的表达变化。内胚层(hSOX17和AFP)、中胚层(hT(Brachyury)和BMP4)、外胚层(OTX1和SOX1)均能在7dpd时显著增加。图B中PCR扩增片段为：SOX17 (199bp)；AFP (215bp)；BMP4 (112bp)；hT(Brachyury) (121bp)；SOX1 (425bp)；OTX1 (121bp)。*，非特异扩增条带(大小不符)。实际检测效果会因实验条件等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

本产品在使用碧云天的BeyoEmbryo™ Human Vitronectin (C0318/C0319)包被的情况下，连续培养人胚胎干细胞50代后仍能保持未分化状态和遗传稳定性(图5)。

图5.使用碧云天的BeyoES™人多能干细胞培养液(C0800)并使用碧云天的BeyoEmbryo™ Human Vitronectin (C0318/C0319)包被的情况下，人胚胎干细胞H9细胞连续培养传代50次后仍能保持未分化状态并具有遗传稳定性。图A，免疫荧光检测发现多能干细胞标志物Tra-1-60、SOX2和OCT4高水平表达，表明细胞处于未分化状态。图B, 免疫荧光检测发现内、中、外胚层早期分化标志物AFP、hT(Brachyury)和Nestin均为阴性，表明细胞处于未分化状态。图中绿色代表相应蛋白标志物的免疫荧光染色，蓝色为DAPI染色。图C, 传代50次后的H9克隆核型分析(Karyotype analysis)显示长期传代后的遗传稳定性(染色体数量)。实际检测效果会因实验条件等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

本产品在使用碧云天的BeyoEmbryo™ Human Vitronectin (C0318/C0319)包被的情况下，连续培养人胚胎干细胞50代后的多能干细胞三胚层分化潜能检测如图6所示。

图6.使用碧云天的BeyoES™人多能干细胞培养液(C0800)连续传代H9细胞50次后仍具有三胚层分化潜能。图A，H9克隆制备为单细胞后(0dpd)，自发分化下形成拟胚体(3dpd和5dpd)，并在6dpd接种到BeyoEmbryo™ 0.1%明胶溶液(C0316)包被下培养24小时(7dpd)后形态学特征。图B，qRT-PCR定量分析对比0dpd (未分化)和自发分化7天(7dpd)后，多能性(Pluripotency)标志基因NANOGmRNA水平大幅下降，而三胚层分化标志物SOX17 (内胚层)、hT(Brachyury) (中胚层)和Nestin (外胚层)均明显上调，提示在连续传代50次的长期培养下，本产品仍然能维持多能干细胞的三胚层分化潜能。实际检测效果会因实验条件等的不同而存在差异，图中效果仅供参考。

-20ºC保存，一年有效。BeyoES™人多能干细胞基础培养液，4ºC保存，半年有效；配制完毕的人多能干细胞完全培养液，4ºC保存，2周内有效。

BeyoES™人多能干细胞基础培养液和配套的添加剂须在4ºC或室温解冻，同时须避免反复冻融，不能在37ºC解冻，否则会影响培养液效价。室温解冻时，完全融化后即可使用，尽量缩短在室温放置的时间。

BeyoES™人多能干细胞培养液各成分经过优化，支持hESC/hiPSC的长期培养，无须自行补充或添加其它成分。

人多能干细胞完全培养液不能频繁在4ºC和37ºC之间转换，否则会导致人多能干细胞完全培养液中含有的成份失活，建议每次实验前取所需量的人多能干细胞完全培养液平衡至室温或酌情平衡至37ºC后尽快使用。

在细胞复苏过程中，转移、吹打混匀和重悬细胞时，吹打力度要轻柔，并尽量减少吹打次数，细胞接种后，观察细胞团块的大小，10个左右细胞的团块为最佳，如果吹打力度过大或吹打次数过多，则会导致细胞分散成单细胞，细胞复苏率将变低。

细胞传代时应选择合适的消化时间和吹打次数，使传代后得到大小合适的细胞团块，细胞团块过大或过小均会导致细胞传代后贴壁率降低。

确保培养器皿已包被Matrix-Gel™基质胶(C0371-C0396)、Matrigel或其它适合多能干细胞生长的基质例如BeyoEmbryo™ Human Vitronectin (C0318/C0319)等，并均匀分布在器皿底部。

在细胞复苏及传代过程中，确保培养液中加入了使用说明中推荐量的ROCK抑制剂Y-27632 (ROCK抑制剂) (SC0326)。

传代或复苏细胞时，确保细胞团块分散均匀。细胞刚传代或复苏时，小的细胞团呈现非标准克隆形态，培养几天后可恢复正常。

如果细胞克隆形态良好，克隆周边出现零星的分化细胞(≤1%)，可通过BeyoES™多能干细胞克隆消化液(C0881)消化后，高稀释比例传代(≥1:10)去除；如果细胞克隆内部松散、边缘不平滑，在分化比例超过5%情况下，建议丢弃。

在人多能干细胞完全培养液的培养体系中，建议使用非酶的温和的消化方式传代。如果实验需要将细胞团消化为单细胞，建议使用BeyoES™多能干细胞克隆消化液(C0881)或Accutase酶消化5-10分钟。

观察细胞时，从培养箱中取出时间不得超过15分钟。

本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品，不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。