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核酸相关> DNA操作> 基因突变
QuickMutation™ Plus基因定点突变试剂盒
产品编号: D0208S
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D0208S QuickMutation™ Plus基因定点突变试剂盒 10次 421.00元

碧云天生产的QuickMutation™Plus基因定点突变试剂盒(QuickMutation™Plus Site-Directed Mutagenesis Kit)可以快速完成质粒特别是超大质粒(10-35kb)的点突变(point mutation)、多个邻近密码子的突变、单个或多个邻近密码子的缺失(deletion)或插入(insertion)突变。
基因定点突变常用于研究基因的转录调控、RNA或蛋白质的结构和功能,以及用于质粒中部分序列的微调等。
本试剂盒利用了目前最常用的基因点突变技术,只需通过基于PCR的突变质粒的生成,和基于DpnI的模板质粒的消化,转化培养以及后续的酶切或测序鉴定,即可得到预期的突变质粒(参考图1)。DpnI消化仅需5分钟,累计操作时间约2-3小时即可完成基因的定点突变。

图1.基因定点突变试剂盒原理图

本试剂盒使用了最新的保真性更强,灵敏度更高,扩增速度可达2kb/min,扩增长度可达35kb的BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase,从而大大缩短了突变反应所需的时间,进一步提高了基因定点突变的成功率。同时进一步严格验证了试剂盒中的DpnI,确保能在5分钟内充分消化掉甲基化的模板质粒,同时不会消化未甲基化的PCR产物。
参考图1,使用本试剂盒时需要先设计长度通常为25-45个碱基互补的两个引物,在引物中含有预期的突变位点。然后以待突变的质粒为模板,用这两个引物进行PCR扩增反应。这样可以产生含有预期的突变位点的双链质粒,但这个双链质粒中有两个nick位点。待突变的质粒通常来源于DH5α等dam+大肠杆菌,在这些dam+细菌中质粒会被甲基化修饰,而在体外通过PCR扩增得到的质粒不会被甲基化。这样用特异性识别甲基化位点的酶DpnI处理,可以消化掉待突变的质粒模板,而使通过PCR扩增出来的含有突变位点的质粒被选择性地保留下来。随后把DpnI处理过的产物转化感受态细菌后,突变质粒中的两个nick位点可以被大肠杆菌修复,得到的克隆就会含有预期的突变质粒了。
本试剂盒提供了DH5α甘油菌,可用于感受态细菌的制备。
经检测,本试剂盒可对长达14kb的模板质粒完成定点突变PCR扩增(图2):

图2. 使用本试剂盒对pcDNA3.1-SRCAP(14566bp)质粒进行点突变时的PCR及PCR酶切后的电泳效果图。图A. pcDNA3.1-SRCAP质粒大小的酶切鉴定电泳图。XbaI酶切后产生两条带,一条带为9173bp, 另一条带为5393bp。图B. pcDNA3.1-SRCAP点突变PCR后DpnI消化前后的质粒电泳图。1. DNA ladder (D0110);2. DpnI消化前的PCR产物,3. DpnI消化后的PCR产物。
本试剂盒使用pcDNA3.1-SRCAP(14566bp)质粒进行了点突变测试,实测突变率接近100%(参考图3)。实际进行点突变时,可能会因为突变引物的设计、模板使用量、感受态效率等因素出现不同的突变率。

图3. 本试剂盒对pcDNA3.1-SRCAP(14566bp)质粒进行点突变的实际效果图。A. 使用本试剂盒进行点突变获得的LB平板照片。以pcDNA3.1-SRCAP质粒为模板,使用本试剂盒进行PCR扩增以实现点突变,DpnI 37℃消化5min,取10µl产物转化100µl DH5α感受态,涂板后37℃培养过夜所获得的LB平板照片。B. 阴性对照LB平板照片。与A相比没有添加BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase,这样模板质粒完全被DpnI酶所消化,没有任何的假阳性克隆产生。C. 突变前后的测序图。突变前的测序结果(WT, wild type)和从图A中挑取9个克隆的测序结果(Mu, mutant)。箭头所示为拟突变的两个位点,红色下划线的为突变前和突变后的碱基。本次实验的突变率达到了100%。
本试剂盒共可以进行十次基因定点突变反应。

包装清单:

产品编号 产品名称 包装
D0208S-1 BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase 10μl
D0208S-2 10X BeyoAmp™ Buffer (with Mg2+) 100μl
D0208S-3 dNTP Mix (2.5mM each) 50μl
D0208S-4 DpnI 10μl
D0208S-5 DH5α甘油菌 200μl
D0208S-6 Nuclease-Free Water 1ml
说明书 1份

保存条件:
-20℃保存,一年有效。
注意事项:
需自行配制LB液体培养基和LB平板以用于细菌的培养。
需自行设计和合成用于基因定点突变的引物。需自备用于细菌转化的试剂。
使用本试剂盒前请先阅读后面的常见问题。
本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 引物设计:
用于特定基因突变的引物需要单独设计,请参考如下一些基本原则进行设计:
a. 共需设计两条互补的引物。可以先集中设计一条,然后就可以得到互补的另一条引物。
b. 引物的长度通常为25-45个碱基。
c. 利用如下公式进行引物Tm值的估算,通常Tm值应该不低于78℃。
Tm= 81.5 + 0.41(%GC) - (675/N) - %mismatch
N表示引物所含碱基总数
%GC表示引物中GC碱基数占引物总碱基数的百分值,例如GC含量为50%,那么%GC就是50。
%mismatch表示引物中突变碱基数占引物总碱基数的百分值,例如错配率是2.5%,那么%mismatch就是2.5。
例一:对于模板序列5'-CCAATTTCGAGGAATTAGAACCTTATTTTGAACTTACTGAAGG-3',其中带有灰色阴影的A为待突变位点,需要突变为C,设计正向突变引物如下:
5'-CCAATTTCGAGGAATTAGCACCTTATTTTGAACTTACTGAAGG-3'
Tm = 81.5 + 0.41*(15/43)*100 - (675/43) - (1/43)*100 = 77.8
例二:对于模板序列5'-GGGAGCTCACCAAGCTGAAGAGCACCTACATTGA-3',其中两个有灰色阴影的A为待突变位点,均需要突变为G,设计正向突变引物如下:
5'-GGGAGCTCACCAGGCTGAGGAGCACCTACATTGA-3'
Tm = 81.5 + 0.41*(20/34)*100 - (675/34) - (2/34)*100 = 79.9
对于插入、缺失型的突变引物,推荐利用如下公式进行引物Tm值的估算:
Tm=81.5 + 0.41(%GC) ‒ (675/N)
此公式中,N不包含插入或缺失的碱基。因为如果N包含插入或缺失的碱基,数字可能会比较大,从而影响计算结果。
d. 也可以利用如下公式进行引物设计。
引物中突变位点任何一侧都必需满足4*(GC碱基数) + 2*(AT碱基数) ≥ 45。但引物也不宜过长,否则通常会形成非常稳定的二级结构。通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右,且使两侧按照上述计算得到的数值相近。
例如引物为AGTCAGGCCAATTCGAAGCAGTCGAATTGCCAAG,其中有灰色阴影的AAG为突变位点,则
左侧:4*(GC碱基数) + 2*(AT碱基数) = 4*8 + 2*7 = 46 ≥ 45
右侧:4*(GC碱基数) + 2*(AT碱基数) = 4*8 + 2*8 = 48 ≥ 45
e. 上述c和d这两种方法的计算标准有较明显的差异,但经过多次测试,两种方法都可以顺利获得预期的突变。
f. 在可能的情况下,尽量把引物的GC含量控制在40-60%。
g. 在可能的情况下,尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。二级结构和二聚体可通过一些软件进行分析。
h. 最好使用经过PAGE纯化的引物或更高纯度的引物。
2. 引物的配制:
如果合成得到的一个引物A的量是20nmol,另外一个互补引物B的量是19nmol。在引物A中加入200μl水,配制成浓度为100μM,在引物B中加入190μl水也配制成浓度为100μM。吸取20μl 100μM引物A和20μl 100μM引物B到一新的离心管中,再加入160μl水,混匀后即可得到可以直接用于基因定点突变反应的引物(10μM each)。
3. 待突变模板质粒的选择:
选择GC含量在40-55%的待突变模板质粒,并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果GC含量过高,请先把目的基因克隆到其它合适的载体上,再进行基因定点突变反应。另外目的基因GC含量最好也在40-55%的范围,并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果目的基因GC含量过高,而突变位点不在高GC含量区域,可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来,进行定点突变,然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的质粒模板,或者有局部高GC含量的质粒模板,请另外使用专门用于高GC含量模板的PCR反应试剂。
必须使用从dam+的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变。常用的大部分大肠杆菌都是dam+的,包括DH5α、JM109等。
4. 基因定点突变反应:
a. 如下设置基因定点突变反应体系:

扩增片段小于6kb 扩增片段大于6kb
试剂 最终浓度 体积 最终浓度 体积
Nuclease-Free Water - ?μl - ?μl
10X BeyoAmp™ Buffer (with Mg2+) 1X 5μl 1X 5μl
引物混合物(10μM each) 0.2μM  2μl 0.4μM  4μl
dNTP mix (2.5mM each) 0.25mM  5μl 0.5mM 10μl
待突变模板质粒 200ng ?μl 200ng ?μl
BeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase 1/50 1μl 1/50 1μl
总体积 - 50μl - 50μl

按照上面的顺序依次加入各种试剂。在上述反应体系中,根据待突变模板质粒的量,计算出需加入的Nuclease-Free Water的量,使总体积为49μl。适当混匀后,加入1μlBeyoAmp™ Extra-long DNA Polymerase,混匀。如果用的PCR仪没有热盖,在反应体系上加入一滴矿物油(mineral oil)以防止蒸发。
b. 按照如下参数设置PCR仪:

步骤 循环数 温度 时间 说明
1 1 95℃ 3min 最初变性
2 20 95℃ 30sec 变性
55℃ 30sec 退火
68℃ 30sec/kb 延伸
3 1 68℃ 10min 延伸、补全
4 1 4℃ 长时间保持 暂时存放

       说明:上面表格中30sec/kb表示,如果待突变的质粒为14kb,那么68℃的延伸时间为7分钟。
5. DpnI消化:
PCR反应后,直接在PCR反应体系中加入1μl DpnI,混匀后37℃孵育5min。37℃孵育可以在PCR仪上进行,也可以在水浴锅中进行。DpnI消化完毕后可以直接用于转化,或者-20℃保存备用。
6. 转化、挑克隆鉴定:
感受态细菌的转化效率必需至少在107以上,否则很难得到克隆。根据所使用的感受态细菌,加入尽量多的经过DpnI消化后的突变产物用于转化。通常每100μl感受态细菌中可以加入5-10μl经过DpnI消化后的突变产物。按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作,在涂板前通过离心浓缩的办法,把所有被转化后的细菌,全部涂布到含有适当抗生素的平板上,培养过夜。通常会得到100个以下的克隆。如果发现有上千个克隆,那么通常是有什么地方出了问题。
对于得到的克隆,可以挑取3-5个克隆送样测序去测序,以确认得到的克隆是否是预期的突变克隆。通常大部分的是预期的突变克隆。但有时也可能会因为随机因素,会测序了3-5个克隆才得到一个预期的突变克隆。

常见问题:
1. 转化后没有克隆或克隆数极少:
a. 感受态细菌效率不够高,请检测一下感受态细胞的效率,确保转化效率在107以上,当然高一些更好。
b. 把DpnI消化后的产物用常规的乙醇沉淀方法进行沉淀,然后溶解在较小的体积中。这样就可以把所有的产物全部用于转化。
c. 优化基因定点突变中的PCR参数。可以把最初的95℃变性时间延长为5min,循环中95℃变性的时间延长至1min,把循环中的68℃的延伸时间改为1min/kb 至2min/kb,退火可以改为60-55℃或65-55℃等的touch down,退火时间也可以适当延长。
d. 引物设计有问题。通过突变反应中的PCR没有很好地扩增出预期的突变质粒。
e. 如果使用矿物油(mineral oil),在转化时如果把矿物油带入感受态菌,会严重影响转化效率。
2. 有克隆,但没有或很难检测到预期的突变克隆:
a. DpnI消化效果不佳。一种可能是加入DpnI后,由于该酶在甘油中,会迅速下沉,如果没有混匀就会严重影响DpnI的消化作用。另一种可能是DpnI由于保存不当或保存时间过长等原因导致活性下降,这时可以适当延长消化的时间至1-2小时。
b. 使用的待突变的模板质粒量过多,导致DpnI消化时不完全。我们这里推荐的模板质粒用量0.5μg,已经是模板质粒用量的上限,不能再使用更多的模板质粒了。
c. 尽量避免多次反复冻融dNTP。可以把dNTP适当分装后再使用。
3. 有突变克隆,但突变位点不是预期的位点:
a. 引物设计不佳,并且PCR反应中退火温度过低,导致引物退火到错误的地方。
b. 引物质量较差,没有经过PAGE纯化。这样引物中通常会含有比设计的引物要短的特异性较差的引物,容易导致非预期的突变。

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