使用说明：
1. 在使用前需将本产品混匀，使用DMSO (ST038)或超纯水(ST873/ST876)对本产品进行稀释。通常可将本产品稀释至20X待用，例如10µl SYBR Green I (10,000X in DMSO, qPCR Grade)加入5ml超纯水，即为SYBR Green I (20X)。
2. 参考下表在室温或冰浴上设置qPCR反应体系(以96孔板为例)：

Reagent	Final Concentration	Volume for One qPCR Reaction (20μl)
10X PCR Buffer (with Mg2+)	1X	2μl
dNTP (2.5mM each)	0.2mM each	1.6μl
Template DNA	1-10ng cDNA	x μl
SYBR Green I (20X)	0.2X-1X	0.2-1μl
Forward and Reverse Primer Mix (2.5μM each)	0.25μM	2μl
Taq DNA Polymerase (5U/μl)	0.5U/20μl	0.1μl
Ultrapure Water	-	To 20μl

注1：SYBR Green I的加入会影响镁离子(Mg2+)的最佳浓度，镁离子浓度影响引物退火、产物特异性和酶活性，而提高镁离子浓度能够降低SYBR Green I对PCR反应的抑制作用[4]。因此，在使用SYBR Green I进行qPCR反应时，镁离子浓度要比无SYBR Green I的普通PCR反应高0.5-3mM。
注2：通常DNA模板的量以1-10ng cDNA或10-100ng基因组DNA为参考用量。因不同物种的模板中含有的目的基因拷贝数同，如有必要，可对模板进行梯度稀释，以确定最佳的模板使用量。RT-PCR反应得到的cDNA直接作为模板时，其添加量不要超过PCR反应总体积的10%。
注3：SYBR Green I的使用浓度会对实验产生影响，浓度过低会使荧光信号不能反应产物量的变化，影响PCR反应灵敏度；而浓度过高则会抑制PCR反应，降低PCR反应效率。使用时应根据实际情况对其使用浓度进行调整，用户可以在0.2X-1X范围内摸索SYBR Green I的最佳使用浓度。
注4：推荐使用碧云天预先设计、经过qPCR验证、预混的引物对产品。
注5：Taq酶的用量须根据酶活、是否热启动等进行调整。
注6：须根据qPCR是否需要ROX，适当添加ROX。
注7：本qPCR反应体系各组分浓度仅供参考，实际须进行严格的优化。
3. qPCR反应程序：
根据qPCR及Taq酶的扩增效率设置qPCR反应程序。建议采用如下的PCR程序，本程序是以ABI QuantStudio™ 6 Flex荧光定量PCR仪为例：
a. 预变性：95ºC 2分钟；
b. 变性：95ºC 15秒；
c. 退火/延伸：60ºC 15-30秒；
d. 重复步骤b和步骤c，总共40个循环；
e. 熔解曲线分析(可选)：95ºC 15秒, 60ºC 15秒, 95ºC 15秒；
f. 使用荧光定量PCR仪提供的软件分析结果。
注：以上举例为常规qPCR反应系统，仅供参考。实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异，需根据模板、引物、目的片段的特点设定最佳反应条件，并根据比例放大或缩小反应体系。上述为两步法qPCR，如果采用三步法qPCR，只需在退火/延伸后加一步72ºC 30秒，随后重复步骤b、c及增加的这一步骤共40个循环即可。
4. 核酸琼脂糖凝胶电泳的使用，参考以下方式。
方式1：样品中加入SYBR GreenⅠ后电泳。
在电泳之前需配制SYBR GreenⅠ工作液，使用超纯水(ST873/ST876)将10,000X母液稀释100倍至100X。按常规方法配制不加任何染料的琼脂糖凝胶，凝胶厚度不超过5mm。将100X SYBR GreenⅠ工作液与DNA样品或DNA Marker以1:1比例混合，加入6X Loading Buffer (若DNA Marker中已含有Loading Buffer则可不加)，室温静置10min。按常规方式上样、电泳。
方式2：电泳完毕后对琼脂糖凝胶染色。
按照每100毫升缓冲液(TAE、TBE或TE，pH7.5-8.0)加入40微升SYBR GreenⅠ的比例(2500:1)加入SYBR Green (10,000X)，配制成SYBR GreenⅠ染色液。把电泳完毕的琼脂糖凝胶放到适当的容器中，加入适量上述配制好的SYBR GreenⅠ染色液，确保至少盖住凝胶。在摇床上缓慢摇动(30-50rpm)染色30-60分钟。染色的时间根据胶的厚度而定，胶厚则染色时间需要长一些，胶薄则染色时间可以短一些。染色完毕后，可使用约500nm波长蓝光激发或相应的凝胶成像系统检测，也可以使用常规的紫外灯或紫外凝胶成像检测系统，但强度会弱一些。染色液可以重复使用4次左右。如果希望获得更好的染色效果图片，染色后可以使用超纯水适当洗涤，以降低背景荧光。
方式3：琼脂糖凝胶中添加SYBR GreenⅠ。
根据需要配制适当浓度(例如1-3%)的琼脂糖胶液。在琼脂糖完全融解后，适当冷却但又不会使琼脂糖凝固时，按照每100毫升胶液加入20-40微升SYBR GreenⅠ的比例(5000-2500:1)加入SYBR GreenⅠ(10,000X)。混匀后即可把琼脂糖胶液倒入制备凝胶的模具中。适当量的DNA在该胶中电泳35-45min后，用约500nm波长蓝光激发或相应的凝胶成像系统检测，就可以观察到明亮的核酸条带。也可以使用常规的紫外灯或紫外凝胶成像检测系统，但强度会弱一些。
注1：可根据实际染色效果对SYBR GreenⅠ的使用浓度进行适当的调整。
注2：方式2即“电泳完毕后对琼脂糖凝胶染色”的效果相对更好一些，但SYBR GreenⅠ的整体染色效果一般，特别是1000bp以下的小片段。对于蓝光下检测，更推荐NA-Green (EB升级换代产品, 2000X) (D0133/D0135)、NA-Green Plus (EB升级换代产品, 2000X) (D0136)、Gel-Green (EB升级换代产品, 10000X) (D0143/D0145)、Gel-Green Plus (EB升级换代产品, 10000X) (D0147)，效果更佳。
参考文献：
1. Marilynn R Fairfax, Hossein Salimnia. Molecular Diagnostics. 2010. Pages 3-14.
2. Cao H, Shockey JM. J Agric Food Chem. 2012. 60(50):12296-303.
3. Xiang D, Zhai K, Xiang W, Wang L. Talanta. 2014. 129:249-53.
4. Karsai A, Müller S, Platz S, Hauser MT. Biotechniques. 2002. 32(4):790-2, 794-6.
相关产品：

产品编号	产品名称	包装
D7405-0.1ml	SYBR Green I (10,000X in DMSO, qPCR Grade)	0.1ml
D7405-0.5ml	SYBR Green I (10,000X in DMSO, qPCR Grade)	0.5ml
D7405-2ml	SYBR Green I (10,000X in DMSO, qPCR Grade)	2ml
R0021	DEPC水(DNase、RNase free)	100ml
R0022	DEPC水(DNase、RNase free)	500ml
ST038-100ml	DMSO	100ml
ST038-500ml	DMSO	500ml
ST873-100ml	BeyoPure™ Ultrapure Water (PCR级, Sterile)	100ml
ST876-100ml	BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free,Sterile)	100ml
ST876-500ml	BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free,Sterile)	500ml