使用说明:
1. 质粒的扩增和鉴定:
a. 扩增:请先取少量本质粒转化Stbl3感受态细胞或其它适当的感受态细胞,Amp抗性,进行质粒的小量、中量或大量抽提后再用于后续用途。
b. 鉴定:抽提获得的质粒可使用菌落PCR的方法进行鉴定,Forward primer为5′TATACGATACAAGGCTGTTAGAGAG3′,Reverse primer为5′ACTGTGGGCGATGTGCGCTCTG3′,PCR产物约为700bp。也可进一步测序鉴定,测序引物为hU6,Forward primer为5′ATGGACTATCATATGCTTACCGTA3′。比对序列为:
ATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG
NNNN
NNNNNNNNNNNNNNNNGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCAC
CGAGTCGGTGCTTTTTTG。其中
N为sgRNA序列。
2. 慢病毒包装与浓缩:
a. 细胞的准备:复苏用于慢病毒包装的HEK293T细胞,24小时后1:3传至10cm培养皿,37℃、5% CO
2培养箱24小时。复苏后的细胞尽量能培养一周以上后再进行慢病毒的包装,效果更好。
b. 慢病毒的包装:对于10cm培养皿,在500µl不含抗生素和血清的DMEM培养液(高糖DMEM或低糖DMEM均可)或Opti-MEM
® Medium中加入本sgRNA质粒、pMDLg、Rev、VSV-g分别为10µg、6.5µg、2.5µg、3.5µg,混匀后加入一定量转染试剂和培养液混合液,转染试剂推荐使用
Lipo293™转染试剂(C0521)、
Lipo6000™转染试剂(C0526)、
Lipo8000™转染试剂(C0533)或其它合适的转染试剂,具体转染步骤参考特定转染试剂的产品说明书。转染后24小时和48小时可两次收集培养液上清,上清用0.45µm的针头滤器进行过滤,该上清含慢病毒,可直接使用。上清可分装后-80℃冻存。
c. 慢病毒的浓缩:如果需要滴度更高的慢病毒,可以使用100kDa的超滤管进行超滤浓缩,如碧云天的
超滤管(15ml, 100kDa MWCO, PES, Sartorius分装) (FUF158)或Amicon
® Ultra-15 Centrifugal Filter Unit (UFC9100),4℃、按照推荐的最高转速离心30分钟左右,最终剩下约400µl的病毒浓缩液。病毒浓缩液可以分装后-80℃冻存。
3. 慢病毒的感染:
a. 确定puromycin的筛选浓度:待感染的细胞按一定密度铺在12孔或24孔中,按照0、0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5µg/ml这样的浓度测试细胞对puromycin的敏感性,推荐使用碧云天的
Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素) (ST551)。两天后细胞全部死亡的最低浓度即为该细胞的puromycin筛选浓度,具体步骤参考碧云天该产品的使用说明:
https://www.beyotime.com/product/ST551-10mg.htm。
b. 慢病毒感染细胞:按实验需要将细胞铺板(如12孔板),细胞数以第2天密度约50%为宜。设置非感染细胞组、对照组和基因敲除组。37℃培养过夜后,培养液中加入5~10μg/ml的Polybrene(
C0351/
ST551)。病毒感染前,从-80℃冰箱取出病毒后冰浴融化,参考相关文献或者根据预实验得到的MOI值加入适量病毒,对于未浓缩的病毒,可以直接按0.5ml/孔加入细胞,对于浓缩或测定滴度的病毒,一般100µl/孔或10
7 TU已经足够,轻轻摇匀,37℃继续培养。两天后,吸除含病毒的培养液,换为新鲜的含一定浓度的puromycin的培养液进行筛选,一般筛选2天后,非感染细胞组细胞逐渐死去,加入病毒组存活率比较高,就可以收集部分细胞检测目的蛋白的表达或进行其它实验。培养过程中,可以将细胞转至6孔板或10cm培养皿进行扩大培养。一周之后,puromycin浓度可减半。如果有必要后续可以通过将细胞稀释至2.5个/ml,然后按照每孔200µl接种到96孔板中(每孔平均0.5个细胞),筛选单克隆细胞株。病毒感染的方法可参考
Polybrene (C0351)的使用说明:
https://www.beyotime.com/product/C0351-1ml.htm。
4. 直接转染细胞与稳定株的筛选
a. 选择合适的拟敲除目的基因的细胞,使用
Lipo8000™转染试剂(C0533)、
Lipo6000™转染试剂(C0526)或其它合适的转染试剂,具体转染细胞的步骤参考特定转染试剂的产品说明。
b. 确定puromycin的筛选浓度:细胞按一定密度铺在12孔或24孔中,按照0、0.2、0.5、1、1.5、2、3、4、5µg/ml这样的浓度测试细胞对puromycin的敏感性,推荐使用碧云天的
Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素) (ST551)。两天后细胞全部死亡的最低浓度即为该细胞的puromycin筛选浓度,具体步骤参考碧云天该产品的使用说明:
https://www.beyotime.com/product/ST551-10mg.htm。
c. 转染后约48小时,按照上述检测获得的puromycin筛选浓度加入puromycin,筛选阳性细胞。一般筛选2天后,阴性细胞逐渐死去。培养过程中,可以将细胞转至6孔板或10cm培养皿进行扩大培养。一周之后,puromycin浓度可减半。如果有必要后续可以通过将细胞稀释至2.5个/ml,然后按照每孔200µl接种到96孔板中(每孔平均0.5个细胞),筛选单克隆细胞株。
5. 基因编辑的鉴定:
a. 对于多克隆细胞,可以通过T7 Endonuclease I (T7EI)进行鉴定,即提取细胞的基因组DNA,在sgRNA序列两边设计引物进行PCR扩增,然后进行T7EI酶切,具体请参考碧云天的
T7 Endonuclease I (CRISPR等基因突变鉴定用) (D7080)或
基因组编辑突变检测试剂盒(D0508);也可以通过相应的抗体进行检测。
b. 对于单克隆细胞,可通过PCR扩增出sgRNA靶向的基因片段后进行常规测序的方式进行验证,同时也可以使用相应的抗体进行检测。
相关产品:
产品编号 |
产品名称 |
包装 |
L00002-5µg |
CRISPR/Cas9 Packaging Vectors Set A |
5µg/each |
L00002-100µg |
CRISPR/Cas9 Packaging Vectors Set A |
100µg/each |
L00011-5µg |
pLenti-Control-sgRNA |
5µg |
L00011-100µg |
pLenti-Control-sgRNA |
100µg |
L00013-5µg |
pLenti-GFP-sgRNA |
5µg |
L00013-100µg |
pLenti-GFP-sgRNA |
100µg |
C0222 |
青霉素-链霉素溶液(100X) |
100ml |
C0351-1ml |
Polybrene (Hexadimethrine Bromide) |
1ml |
C0351-50mg |
Polybrene (Hexadimethrine Bromide) |
50mg |
C0521 |
Lipo293™转染试剂 |
0.5/1.5/7.5ml |
C0526 |
Lipo6000™转染试剂 |
0.5/1.5/7.5ml |
C0533 |
Lipo8000™转染试剂 |
0.5/1.5/7.5ml |
D0378 |
Stbl3甘油菌 |
200μl |
ST551-10mg |
Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素) |
10mg/ml×1ml |
ST551-50mg |
Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素) |
10mg/ml×5ml |
ST551-250mg |
Puromycin Dihydrochloride (嘌呤霉素) |
250mg |
ST1380-500mg |
Polybrene (≥94%, Reagent grade) |
500mg |
ST1380-2g |
Polybrene (≥94%, Reagent grade) |
2g |
ST1380-10g |
Polybrene (≥94%, Reagent grade) |
10g |
FF345-10pcs |
针头滤器(0.45µm/28mm, PES, Sterile, Sartorius分装) |
10个/袋 |
FF345T-10pcs |
针头滤器(0.45µm/28mm, PES, Sterile, 进口分装) |
10个/袋 |
FF345-50pcs |
针头滤器(0.45µm/28mm, PES, Sterile, Sartorius原装) |
50个/盒 |
FF365-10pcs |
BeyoGold™针头滤器(0.45µm/33mm, PES, Sterile) |
10个/袋 |
FF365-100pcs |
BeyoGold™针头滤器(0.45µm/33mm, PES, Sterile) |
100个/盒 |
FF375-10pcs |
BeyoGold™针头滤器(0.45µm/13mm, PES, Sterile) |
10个/袋 |
FF375-100pcs |
BeyoGold™针头滤器(0.45µm/13mm, PES, Sterile) |
100个/盒 |
FUF158-2pcs |
超滤管(15ml, 100kDa MWCO, PES, Sartorius分装) |
2个/袋 |
FUF158-12pcs |
超滤管(15ml, 100kDa MWCO, PES, Sartorius分装) |
12个/袋 |