使用说明：
1.样品的准备。
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25℃下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素进行抗凝，4℃约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20℃或-80℃。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，吸净培养液，如有必要可以使用PBS洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g, 5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体，如有必要可以使用PBS洗涤一次并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl本试剂盒提供的Assay Buffer，适当吹打以裂解细胞，如有必要可以冰浴5-10分钟以进一步充分裂解细胞。4℃约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl Assay Buffer的比例进行匀浆；或者组织样品液氮研磨后按照每10mg组织样品加入100μl Assay Buffer的比例进行裂解，如有必要可以冰浴5-10分钟以使裂解充分。4℃约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4℃或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20℃或-80℃冻存。
c.样品MMP-3活性检测时空白对照的准备：推荐使用Assay Buffer作为空白对照(Blank Control)，或者使用适当的用于样品裂解或稀释的裂解液或稀释液作为空白对照。
2.试剂盒的准备。
将Assay Buffer、Substrate、MCA Standard (10mM)和α-Chymotrypsin平衡至室温后分别混匀备用。其它试剂存置于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
3.阳性对照的准备以及样品中MMP-3前体的激活。
本试剂盒中的MMP-3 Positive Control (10X)为MMP-3前体，作为阳性对照使用之前需要使用试剂盒中提供的α-Chymotrypsin进行激活处理。此外，由于细胞、组织或血液等样品中含无活性的MMP-3前体和有活性的激活成熟的MMP-3，如果需要检测总MMP-3活性，则需要使用试剂盒中提供的α-Chymotrypsin进行预处理以激活MMP-3前体。如果只需要检测样品中已激活的MMP-3活性，则不需要使用α-Chymotrypsin进行预处理，但仍建议加入Serine Proteinase Inhibitor以抑制样品中可能的其它丝氨酸蛋白水解酶。
a.阳性对照的准备：取适量MMP-3 Positive Control (10X)，并按后续步骤进行处理。例如，取2μl的MMP-3 Positive Control (10X)，加入17μl Assay Buffer并混匀，再加入1μl α-Chymotrypsin并混匀，37℃孵育5min。再加入1μl Serine Proteinase Inhibitor以抑制多余的α-Chymotrypsin活性，混匀并放置1-2min，即得激活的MMP-3 Positive Control (1X)。96孔板检测时，通常每孔加入5μl MMP-3 Positive Control (1X)作为阳性对照即可。注：如果阳性对照由于反复冻融或其它原因导致效价降低，96孔板检测时也可以每孔加入10μl。
b.(选做)样品中MMP-3前体的激活。如果需要检测包含未激活的MMP-3前体的总MMP-3活性，需要进行本操作步骤。取适量的样品于1.5ml离心管中，加入1μl α-Chymotrypsin，再加入Assay Buffer补足至20μl，混匀，37℃孵育5min。
c.样品中丝氨酸蛋白水解酶的抑制。取适量样品加入Assay Buffer补足至20μl，或取步骤3b中经α-Chymotrypsin处理的样品，加入1μl Serine Proteinase Inhibitor，混匀并放置1-2min。此时样品的稀释倍数(21 /样品微升数)记录为Dil₁。
d.(选做)总MMP-3活性检测时空白对照的准备：在1.5ml离心管中加入19μl Assay Buffer及1μl α-Chymotrypsin，混匀，37℃孵育5min。加入1μl Serine Proteinase Inhibitor，混匀并放置1-2min，即为空白对照(Blank Control)。
4.MCA标准曲线设置。
取2μl MCA Standard (10mM)，加入198μl Assay Buffer，混匀，即为200μl 100μM的MCA溶液，分别取0、1、2、5、10、20、50μl的100μM MCA溶液加入96孔板中，并用Assay Buffer补足至100μl，此时，MCA标准曲线的各孔MCA浓度和物质的量分别为0、1、2、5、10、20、50μM或0、0.1、0.2、0.5、1、2、5nmol。也可自行设置适宜的MCA浓度进行标准曲线的设定。
5.检测体系的设置。
参照下表依次加入试剂盒各组分及样品。初次检测时，待测样品可以稀释一系列浓度梯度，以确保最终检测值在标准曲线线性范围内。此时待测样品的稀释倍数记为Dil₂。

Reagents	Blank Control	Positive Control	Sample
Assay Buffer	90μl	90μl	90μl
MMP-3 Positive Control (1X)	-	5μl	-
Blank Control	5μl	-	-
Sample	-	-	5μl
Total Volume	95μl	95μl	95μl

注1：为获得更加可靠的检测结果，推荐每个样品设置2-3个平行孔。
注1：Blank Control可以是步骤1c中MMP-3活性检测时的空白对照，也可以是步骤3c中总MMP-3活性检测时的空白对照。
6.检测。
a.振荡混匀1-2分钟，确保混合充分。
b.除MCA标准曲线外每孔加入5μl Substrate，混匀。注：加入Substrate后反应会立即开始，如果孔数较多的情况下，建议在低温或使用排枪操作以减小各孔间加入Substrate的时间差而导致的误差，混匀操作可在培养板振荡器上进行。
c.混匀后立即使用荧光酶标仪进行荧光测定。设置荧光酶标仪温度为37℃，激发波长为325nm、发射波长为393nm，每5分钟或10分钟读取一次荧光强度。
注1：连续测定的时间间隔可以根据待测样品中MMP-3的酶活性进行调整，但是需确保获得6个点以上的数据。对于MMP-3的酶活较高的样品，建议测定总时间为20-30分钟，对应的测定间隔时间设为2-5分钟；对于MMP-3的酶活很低的样品，可以延长测定总时间为1-2小时，对应的测定间隔时间设为10-20分钟。
注2：如果荧光酶标仪没有温控功能，也可以在室温测定，但这样检测出来的是室温条件下的酶活性，此时酶活性可能会偏低一些，不同的实验条件偏低的程度会有所不同。或者可以考虑在检测的间隔时间内在37℃孵育。
7.计算。
a.计算每个样品孔和空白对照孔的平均荧光值，可分别记录为RFU空白对照、RFU阳性对照和RFU样品。RFU，Relative Fluorescence Unit。选取待测样品组荧光强度呈线性关系的时间点的数据用于分析，记录呈线性关系的时间间隔为T，时间间隔T内的荧光强度变化量为ΔRFU，即ΔRFU= RFU样品(Time b) - RFU样品(Time a)。也可以直接比较各个样品在一定时间内的ΔRFU而确定样品的MMP-3相对活性，但须确保最终时间点时RFU读数未达平台。
b.将标准曲线各孔的荧光值减去标准品零浓度孔的荧光值，建立MCA标准曲线。将ΔRFU代入标准曲线，即可算出在反应时间内样品中MCA的生成量(记录为A)。MCA的标准曲线请参考图2A，MCA在0.02-5nmol (即0.2-50μM)范围内有良好的线性关系。MMP-3蛋白酶活性的计算公式如下：
MMP-3 Activity (nmol/min/ml或mU/ml) = A× Dil₁×Dil₂/ (V_Sample × T)
注：V_Sample为检测时待测样品的体积，上述的推荐检测系统中为5μl即0.005ml，也可以检测样品的蛋白浓度而用蛋白量进行计算；
A为步骤7b根据标准曲线确定的MCA的生成量(nmol)；
Dil₁为步骤3b中的样品稀释倍数、Dil₂为步骤5中的样品稀释倍数；
T为步骤7a中反应时间(min)。
MMP-3酶活力单位U (Unit)的定义为：1个活力单位的MMP-3酶在37℃条件下，1分钟内催化生成1.0µmol的MCA。也有把该酶活力单位的定义的温度条件设定为室温的。
注：此处温度条件取决于酶标仪检测时设定的温度。
c.虽然本试剂盒中的MMP-3底物特异性已经比较强，而且样品经过Serine Proteinase Inhibitor处理，但仍然有可能有一些蛋白酶可以切割本底物，建议进一步使用MMP-3特异性抑制剂或泛MMP抑制剂如Batimastat (SF4153, IC₅₀=20nM for MMP-3)或Ilomastat (SF4180, IC₅₀=27nM for MMP-3)进行验证。
d.计算示例：待测样品的蛋白浓度经测定为21mg/ml，取1μl的样品于1.5ml离心管中，加入1μl α-Chymotrypsin，Assay Buffer补足至20μl，混匀，37℃孵育5min。加入1μl Serine Proteinase Inhibitor，混匀并放置1-2min。此时样品的稀释倍数Dil₁为21，蛋白浓度为1mg/ml。检测时再将1mg/ml样品稀释10倍，即Dil₂为10，此时蛋白浓度为0.1mg/ml。取5μl稀释后的样品参考步骤5、6进行测定，测定时间设为30分钟。如果0分钟时的RFU待测样品(Time 0) = 35，30分钟时的RFU待测样品(Time 30) = 150，则ΔRFU待测样品 = 150 - 35 = 115，建立MCA标准曲线假设y = 215.59x + 14.812，则115 = 215.59x + 14.812，x = 0.4647，即30min内样品中MCA的生成量A为0.4647nmol。
MMP-3 Activity (nmol/min/ml或mU/ml) = 0.4647× 21×10 / (0.005 × 30) = 650.58nmol/min/ml或650.58mU/ml；
或MMP-3 Activity (nmol/min/mg或mU/mg) = 0.4647× 21×10 / (0.005 × 30 × 0.1) = 6505.8nmol/min/mg或6505.8mU/mg。

图2. 基质金属蛋白酶3 (MMP-3)活性荧光检测试剂盒的MCA标准曲线和对MCA阳性对照及组织、细胞样品的检测效果。A. 本试剂盒的MCA标准曲线示意图。B. 本试剂盒对MMP-3 Positive Control (1X)的检测效果。C. 本试剂盒对小鼠不同组织及293T细胞中的总MMP-3酶活性检测效果。其中小鼠脾、肺、肾脏及小肠组织总蛋白量都为20μg，293T细胞的总蛋白量为40μg。实际检测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

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