产品编号 | 产品名称 | 产品包装 | 产品价格 |
P0339S | 基质金属蛋白酶3 (MMP-3)抑制剂筛选试剂盒 | 100次 | 2060.00元 |
P0339M | 基质金属蛋白酶3 (MMP-3)抑制剂筛选试剂盒 | 500次 | 7250.00元 |
碧云天研发的基质金属蛋白酶3 (MMP-3)抑制剂筛选试剂盒(MMP-3 Inhibitor Screening Kit)是一种用荧光法简单、快速、高通量、高灵敏地筛选基质金属蛋白酶3 (Matrix Metalloproteinase-3, MMP-3)抑制剂的试剂盒。
基质金属蛋白酶3 (MMP-3,也称MMP3)又称基质分解素1 (stromelysin-1),是MMP家族的重要成员之一,分子量约为57kDa。依据结构特点,MMP-3可分为3个结构域。(1)氨基端分泌信号肽和前体肽结构域,由分泌信号肽(约17aa)和前体肽(约80aa)组成。新翻译形成的全长MMP-3称为pre-pro-MMP-3,分泌信号肽可引导新合成的pre-pro-MMP-3分泌到细胞外基质(extracellular matrix, ECM),同时在分泌过程中信号肽被剪切去除而形成MMP-3前体 (pro-MMP-3)。而前体肽中的“半胱氨酸开关”序列中的半胱氨酸与Zn2+协同作用,可以保持pro-MMP-3处于非激活形式。MMP-3前体被纤溶酶(plasmin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)等丝氨酸蛋白水解酶(serine protease)剪切去除包含半胱氨酸开关的前体肽,就会被激活形成具有蛋白酶活性的MMP-3。(2)氨基端催化结构域,其中包含一个保守的Zn2+结合位点,为整个蛋白酶的活性部位。(3)羧基端结构域,该结构域的氨基酸序列与血红素结合蛋白相似,是MMP-3与底物相结合的部位。MMP-3能够降解或剪切多种细胞外基质成分、前体蛋白或前体酶等,具体包括Collagen α-chains, Aggrecan, Laminin, Fibronectin, Elastin, Casein, α-1 Antitrypsin, Myelin Basic Protein, IL-1 β, IGFBP-3, pro-MMP-1, pro-MMP-7, pro-MMP-8, pro-MMP-9, pro-MMP-13等,能破坏肿瘤细胞侵袭的组织学屏障、释放E-钙粘蛋白(E-cadherin)、促进肿瘤侵袭转移、促进炎症反应,在肿瘤等的研究中日益受到重视。此外,MMP-3还参与组织形态发生、损伤修复、炎症反应等一系列生理、病理过程,在风湿性关节炎、动脉粥样硬化等疾病发生发展过程中发挥重要作用。
本MMP-3抑制剂筛选试剂盒采用荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方法,其检测原理如下。MCA是荧光供体(Donor),Dnp是荧光受体(Acceptor)或称为淬灭基团(Quencher),供体的发射光谱和受体的激发光谱有一定的重叠,当这两个荧光基团间的距离合适时(一般7-10nm),荧光能量由供体向受体转移,导致供体荧光分子的荧光强度衰减。MCA和Dnp被连接到MMP-3酶的天然底物上的两端,当MMP-3蛋白酶没有切割该底物时,两个基团足够接近,发生荧光共振能量转移,即Dnp可淬灭MCA的荧光而导致检测不到荧光;当该底物被MMP-3蛋白酶切割后,多肽的首尾两端分离,两个基团分开,MCA的荧光不再被Dnp淬灭,即可检测到MCA的荧光,这样通过荧光检测就可以非常灵敏地检测MMP-3蛋白酶的酶活性。如果在反应体系中加入MMP-3蛋白酶的抑制剂(Inhibitor),荧光的生成会被抑制,荧光强度与抑制剂的抑制效果成反比,这样就可以检测出MMP-3蛋白酶抑制剂的抑制效果。MCA的最大激发波长为325nm,最大发射波长为393nm。
图1. 基质金属蛋白酶3 (MMP-3)抑制剂筛选试剂盒检测原理图。
本试剂盒抑制剂筛选结果真实可信。本试剂盒中使用的全长重组人MMP-3蛋白是碧云天采用自主研发的PerfectProtein™哺乳动物蛋白表达技术平台纯化而来,并已预先激活,酶活性好。本试剂盒中使用的底物特异性好,使用的底物为NFF-3的相应肽段序列,可非常快速地被MMP-3切割(kcat/Km=218,000s-1×M-1),而对于MMP-9则较慢(kcat/Km=10,100s-1×M-1),几乎不会被MMP-1或MMP-2识别而切割,所以NFF-3肽段序列作为底物可以特异性地用于MMP-3活性的检测而区分于其它基质金属蛋白酶。因此本试剂盒用于MMP-3抑制剂筛选时,筛选获得的抑制剂更加真实可信。
本试剂盒稳定性好,检测效果佳。孵育1小时,100%酶活性信号约为背景信号的5-7倍,确保有足够的信号范围用于抑制剂的筛选。通常在孵育1小时内,信号与孵育时间成正比,1小时后即趋于稳定。
本试剂盒中提供了MMP-3酶(MMP-3 Enzyme)、底物(Substrate)、阳性对照抑制剂(GM6001),并且对MMP-3酶和底物的使用量进行了优化,不仅能检测出IC50很低的抑制剂,也能检测出IC50较高的抑制剂。本试剂盒提供的阳性对照GM6001(别名Galardin或Ilomastat ) (SF4180)是一种广谱基质金属蛋白酶抑制剂,作用于MMP-3、MMP-1、MMP-2、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-12、MMP-14和MMP-26,Ki分别为27nM、0.4nM、0.5nM、3.7nM、0.1nM、0.2nM、3.6nM、13.4nM和0.36nM。在本试剂盒中GM6001的IC50约为60nM,实测数据会略有偏差。
对于96孔板,本试剂盒小包装P0339S可以进行100次检测,中包装P0339M可以进行500次检测。
包装清单:产品编号 | 产品名称 | 包装 |
P0339S-1 | Assay Buffer | 30ml |
P0339S-2 | MMP-3 Enzyme | 100μl |
P0339S-3 | Substrate | 500μl |
P0339S-4 | GM6001 (0.1mM) | 20μl |
- | 说明书 | 1份 |
产品编号 | 产品名称 | 包装 |
P0339M-1 | Assay Buffer | 120ml |
P0339M-2 | MMP-3 Enzyme | 500μl |
P0339M-3 | Substrate | 1.25ml×2 |
P0339M-4 | GM6001 (0.1mM) | 100μl |
- | 说明书 | 1份 |
-20℃保存,一年有效。其中Substrate须避光保存。
注意事项:Assay Buffer、Substrate、GM6001 (0.1mM)需完全解冻并平衡至室温后再使用,否则会影响检测结果。MMP-3 Enzyme使用时应置于冰上,使用完毕后各试剂应立即按照试剂盒要求的条件保存。
体积较小的试剂首次使用时建议先离心数秒使液体沉降于管底,然后再使用。结冻的试剂必须完全融化并混匀后使用。
确保加入样品后反应体系的pH值在7-8之间,或确保样品的pH值在7-8之间,否则可能会影响检测结果的信号值和稳定性。
待测抑制剂样品的溶剂可能会对检测产生干扰,推荐使用本试剂盒提供的Assay Buffer作为溶剂用于配制、稀释样品。如果样品必须用其它试剂配制、稀释,请进行一定的测试,并在对照孔中添加与样品等体积的溶剂以排除干扰。经测试,反应体系中DMSO、无水乙醇、甘油浓度达5%时对检测结果没有影响,但仍然建议进行一定的预实验并尽量降低DMSO、无水乙醇、甘油等溶剂在反应体系中的浓度。
尽管经测试本试剂盒中的MMP-3 Enzyme反复冻融5次对活性基本没影响,为取得良好的检测效果,建议第一次使用时适当分装保存。
EDTA等金属螯合剂,对MMP-3酶活性有影响,应避免EDTA等螯合剂的加入。
检测时建议使用96孔黑板,推荐选购碧云天的BeyoGold™全黑96孔细胞培养板(FCP966)。
本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
1 sample | 5 samples | 10 samples | 20 samples | |
Assay Buffer | 89μl | 445μl | 890μl | 1.78ml |
MMP-3 Enzyme | 1μl | 5μl | 10μl | 20μl |
Blank Control | 100% Activity Control | Inhibitor Control | Sample Group | |
Assay Buffer | 90μl | - | - | - |
Assay Reagent | - | 90μl | 90μl | 90μl |
GM6001 (0.1mM) | - | - | 5μl | - |
Sample Solvent | 5μl | 5μl | - | - |
Sample | - | - | - | 5μl |
图2. 基质金属蛋白酶3(MMP-3)抑制剂筛选试剂盒检测GM6001的效果图。实际检测结果可能会因样品和检测条件等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。
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