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多肽与蛋白> 蛋白检测> 蛋白电泳
Tricine-SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(小分子量蛋白用)
产品编号: P0531S
产品包装:30-50gels
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价格: ¥ 229.00
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P0531S Tricine-SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(小分子量蛋白用) 30-50gels 229.00元

碧云天生产的Tricine-SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(小分子量蛋白用) (Tricine-SDS-PAGE Gel Preparation Kit for Small Molecular Weight Protein),提供了配制Tricine-SDS-PAGE凝胶所需的各种试剂,用户只需自备制胶器具和蒸馏水,即可配制不同浓度的Tricine-SDS-PAGE凝胶(即聚丙烯酰胺凝胶)。本产品优化了配方,无须配制夹层胶,且只需一种电泳缓冲液。Tricine-SDS-PAGE凝胶主要用于小分子量蛋白或多肽(1-40kDa)的分析检测,其电泳缓冲系统采用Tris-Tricine电泳缓冲系统,可以对于小分子量的蛋白获得良好的电泳分离效果,适合用于例如胰岛素、β淀粉样蛋白等小分子量蛋白或多肽的电泳以及后续的Western检测。

聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)技术广泛用于蛋白质、核酸及蛋白质-核酸复合物的分离纯化、检测、鉴定、分子量分析等实验,是生命科学研究中最基本的实验技术之一。常见的Western印迹(Western blot)检测就是基于PAGE的。Tricine-SDS-PAGE (基于Tris-Tricine缓冲系统)通常用于分离分子量范围为1-100kDa的蛋白质或多肽。它是分辨小于30kDa的蛋白质首选的电泳系统,对于从生物膜中分离膜蛋白复合物也很有帮助[1]。在传统的Glycine-SDS-PAGE (也被称为Laemmli-SDS-PAGE,基于Tris-Glycine缓冲系统)中,随着电泳的进行,浓缩胶中来自样品和电泳液中SDS的游离的十二烷基硫酸根(Dodecyl sulfate, DS)离子持续累积,并与小分子量蛋白的结合,阻碍了小分子量蛋白的分离,从而导致条带模糊和分辨率降低,干扰小分子量蛋白的固定和染色。在Tricine-SDS-PAGE中,凝胶缓冲液的pH值较低,并在电泳缓冲液中用Tricine替代Glycine,可以有效降低SDS与小分子量蛋白的结合,使小分子量蛋白或多肽能更好地分离,呈现了更清晰的条带和更高的分辨率。同时,Tricine的pKa值为8.15,Glycine的pKa值为9.6,由于pKa的变化,两种方法对高或低分子量蛋白质的分辨率也各不相同。Glycine-SDS-PAGE的凝胶可以分离高分子量蛋白质(20-200kDa),但即使是使用较高的丙烯酰胺(Acrylamide)浓度的凝胶(4-20%梯度凝胶),小于20kDa的蛋白质也会因为扩散等原因较难清楚地分离。Tricine-SDS-PAGE只能用于分离低于100kDa的蛋白质,尤其是20kDa或更低分子量的蛋白质或多肽可以通过这种方法很好地分离[2]。此外,Tricine-SDS-PAGE有助于在蛋白质印迹过程中轻松转移疏水性蛋白质,适用于从二维凝胶中分离疏水性蛋白质以进行质谱分析[3]。

本试剂盒提供的Gel Buffer使用略偏碱性pH的Tris缓冲液制备,具有较低的pH值,尽可能地减少了蛋白质修饰的干扰,适用于变性蛋白电泳。电泳时使用Tris-Tricine缓冲系统的SDS-PAGE电泳液,推荐使用Tricine-SDS-PAGE Running Buffer (10X) (P0739)。电泳后可以使用Tris-Glycine缓冲系统的转膜液进行转膜,推荐使用Western转膜液(P0021AP0021B)。

本试剂盒约可配制30-50块常规大小的Tricine-SDS-PAGE凝胶。具体可以配制的凝胶数量和凝胶的厚薄以及凝胶的大小有关。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
P0531S-1 30% Acr-Bis (29:1) 100ml
P0531S-2 Gel Buffer 150ml
P0531S-3 凝胶聚合催化剂 0.5g
P0531S-4 TEMED Substitute 0.5ml
说明书 1份
保存条件:

4ºC保存,一年有效。Gel Buffer和凝胶聚合催化剂可以室温保存。30% Acr-Bis (29:1)和TEMED Substitute 4ºC避光保存。凝胶聚合催化剂用蒸馏水配制成10%溶液后,分装成小管-20ºC保存,通常半年内有效。

注意事项:

凝胶聚合催化剂用水配制成10%溶液后,应当分装成小管-20ºC保存。同时应尽量减少室温存放时间,以防失效。

TEMED Substitute易挥发,使用后请盖紧瓶盖。另外凝胶凝聚的速度和温度及光照关系密切,可通过适当调节凝胶聚合催化剂和TEMED Substitute的用量,控制在不同的室内环境下凝胶凝聚的速度。

TEMED Substitute易燃,有腐蚀性,操作时请小心,并注意有效防护以避免直接接触人体或腐蚀其他物品。

如果需要30% Acr-Bis (29:1) (ST003)可向碧云天单独订购。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.准备倒胶的模具。可以使用常规的制备蛋白电泳胶的模具,如碧云天的MiniProGel™蛋白制胶与电泳系统(E6001/E6005)或其它适当模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具(如0.75mm厚度),以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果,可以选择可灌制较大Tricine-SDS-PAGE凝胶的模具。制胶前必须把制胶模具冲洗干净,需特别注意不能有SDS残留。
2.10%凝胶聚合催化剂的配制:例如称取0.1g凝胶聚合催化剂,用蒸馏水溶解,并定容至1ml,即为10%凝胶聚合催化剂。
3.常用蛋白电泳胶的模具(胶板宽度为10厘米)所需下层胶和上层胶体积(下层胶按6厘米高度计算,上层胶按1.5厘米高度计算,均含约0.3ml的冗余量)参见下表。
Gel Thickness Volume of Resolving Gel Volume of Stacking Gel
0.75mm 4.0ml 1.0ml
1.0mm 5.4ml 1.5ml
1.5mm 8.0ml 2.0ml
注:下层胶体积已包含适量冗余,请勿全部用于灌制下层胶,以免灌胶时上层胶高度不够。
4.根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度(凝胶浓度越高,更小分子量的蛋白分辨率越好),再按照下面的表格配制Tricine-SDS-PAGE的分离胶(即下层胶):
成分 配制不同体积Tricine-SDS-PAGE凝胶所需各成分的体积(毫升)
7%胶 5 10 20 30 40 50
Ultrapure water 0.98 1.96 3.98 5.99 7.95 9.81
30% Acr-Bis (29:1) 1.17 2.33 4.67 7.00 9.33 11.67
Gel Buffer 2.80 5.60 11.20 16.80 22.40 28.00
10%凝胶聚合催化剂 0.05 0.10 0.15 0.20 0.30 0.50
TEMED Substitute 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02
成分 配制不同体积Tricine-SDS-PAGE凝胶所需各成分的体积(毫升)
9%胶 5 10 20 30 40 50
Ultrapure water 0.65 1.30 2.64 3.99 5.29 6.48
30% Acr-Bis (29:1) 1.50 3.00 6.00 9.00 12.00 15.00
Gel Buffer 2.80 5.60 11.20 16.80 22.40 28.00
10%凝胶聚合催化剂 0.05 0.10 0.15 0.20 0.30 0.50
TEMED Substitute 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02
成分 配制不同体积Tricine-SDS-PAGE凝胶所需各成分的体积(毫升)
10%胶 5 10 20 30 40 50
Ultrapure water 0.48 0.96 1.98 2.99 3.95 4.81
30% Acr-Bis (29:1) 1.67 3.33 6.67 10.00 13.33 16.67
Gel Buffer 2.80 5.60 11.20 16.80 22.40 28.00
10%凝胶聚合催化剂 0.05 0.10 0.15 0.20 0.30 0.50
TEMED Substitute 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02
成分 配制不同体积Tricine-SDS-PAGE凝胶所需各成分的体积(毫升)
12%胶 5 10 20 30 40 50
Ultrapure water 0.45 0.90 1.84 2.79 3.69 4.48
30% Acr-Bis (29:1) 2.00 4.00 8.00 12.00 16.00 20.00
Gel Buffer 2.50 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00
10%凝胶聚合催化剂 0.05 0.10 0.15 0.20 0.30 0.50
TEMED Substitute 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02
成分 配制不同体积Tricine-SDS-PAGE凝胶所需各成分的体积(毫升)
15%胶 5 10 20 30 40 50
Ultrapure water 0.15 0.30 0.64 0.99 1.29 1.48
30% Acr-Bis (29:1) 2.50 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00
Gel Buffer 2.30 4.60 9.20 13.80 18.40 23.00
10%凝胶聚合催化剂 0.05 0.10 0.15 0.20 0.30 0.50
TEMED Substitute 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02
成分 配制不同体积Tricine-SDS-PAGE凝胶所需各成分的体积(毫升)
16%胶 5 10 20 30 40 50
Ultrapure water 0.13 0.26 0.58 0.89 1.15 1.31
30% Acr-Bis (29:1) 2.67 5.33 10.67 16.00 21.33 26.67
Gel Buffer 2.15 4.30 8.60 12.90 17.20 21.50
10%凝胶聚合催化剂 0.05 0.10 0.15 0.20 0.30 0.50
TEMED Substitute 0.002 0.004 0.006 0.008 0.012 0.02
5.按照如下表格配制Tricine-SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶):
成分 配制不同体积Tricine-SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积(毫升)
4%胶 2 3 4 6 8 10
Ultrapure water 1.41 2.11 2.82 4.22 5.64 7.04
30% Acr-Bis (29:1) 0.27 0.40 0.53 0.80 1.07 1.33
Gel Buffer 0.30 0.46 0.60 0.91 1.21 1.52
10%凝胶聚合催化剂 0.02 0.03 0.04 0.06 0.08 0.1
TEMED Substitute 0.002 0.003 0.004 0.006 0.008 0.01
注1:按照上述顺序依次加入各种试剂,加入TEMED Substitute前先混匀,加入TEMED Substitute后立即混匀,并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡,并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡,可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
注2:通常10-30分钟内胶会凝固。具体的凝固时间和温度及光照有关,上表中10%凝胶聚合催化剂和TEMED Substitute的正常推荐用量是室温为25ºC时的推荐用量。为达到与25ºC时相近的凝固时间,当室温低于25ºC时,可以适当增加10%凝胶聚合催化剂和TEMED Substitute的用量,例如20ºC时建议使用正常推荐用量的1.5倍,15ºC时建议使用正常推荐用量的2倍。
注3:浓缩胶中可加入适量蓝色、红色或黄色PAGE上层胶染料(500X, 无迁移) (P0710/P0712/P0715)便于上样。
6.具体的电泳步骤如下。
a.样品准备:将样品和BeyoGel™ Tricine SDS Sample Buffer (2X) (P0750)按1:1混合,95ºC加热5分钟,以充分变性蛋白。
b.将按照本试剂盒使用说明配制好的凝胶固定在电泳槽中,平稳、缓慢地拔出梳子。
c.电泳缓冲液准备。推荐使用Tricine-SDS-PAGE Running Buffer (10X) (P0739)。
d.内槽加满电泳缓冲液,外槽加入电泳缓冲液没过电泳槽底部的阳极即可。电泳槽推荐使用碧云天的MiniProGel™蛋白制胶与电泳系统(E6001/E6005)。
e.上样:将10微升吸头或BeyoGold™凝胶电泳上样吸头(FTIP205/FTIP206/FTIP208/FTIP209)的尖端垂直方向轻轻插入到上样孔中即可上样,枪头避免戳破凝胶,更不能使胶板变形导致样品泄漏。推荐使用碧云天小分子量的BeyoColor™彩色预染蛋白分子量标准(2.7-40kD) (P0771)。
注:最佳上样量须通过实验来确定,样品过量较易导致条带拖尾和信号过强。
f.将电泳槽盖子盖好,并将电源线插头插入电泳仪电源插孔(红对红,黑对黑)。一般在150V电压,电泳40-50分钟左右即可,或溴酚蓝条带电泳至凝胶近底部或实验预定的位置。如果需获得更加平整和锐利的条带,可以把电压调整为100-150V,此时电泳时间需要适当延长。实际电泳时间与电泳液质量、凝胶数量等因素有关系,需自行适当调整。电泳电源推荐使用碧云天的BeyoPower™中电流电源(300V/600mA/100W) (E6080)或BeyoPower™高电流电源(300V/2000mA/200W) (E6085)。
g.转膜:推荐使用Western转膜液(P0021AP0021B)。转膜时,建议将转膜液中的乙醇或甲醇含量提高至20%-30%,以提高小分子蛋白的转膜效率。同时建议使用0.22μm的印迹膜进行转膜。通常湿转的电流为300-400mA,转膜30-60分钟。转膜电源推荐使用碧云天的BeyoPower™高电流电源(300V/2000mA/200W) (E6085),转膜推荐使用碧云天的MiniBlot™蛋白转膜系统(E6050)或MiniBlot™蛋白转膜转移芯(E6053)。详细的Western操作可以参考碧云天的相关网页:
http://www.beyotime.com/support/western.htm
参考文献:
1.Schägger H. Nat Protoc. 2006. 1(1):16-22.
2.Haider SR, Reid HJ, Sharp BL. Methods Mol Biol. 2019. 1855:151-160.
3.Haider SR, Reid HJ, Sharp BL. Anal Bioanal Chem. 2010. 397(2):655-64.
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产品编号 产品名称 包装
P0531S Tricine-SDS-PAGE凝胶配制试剂盒(小分子量蛋白用) 30-50gels
P0532S BeyoGel™小分子量蛋白预制胶(Tricine, 16.5%, 10孔) 10块
P0533S BeyoGel™小分子量蛋白预制胶(Tricine, 16.5%, 15孔) 10块
P0739 Tricine-SDS-PAGE Running Buffer (10X) 100/500ml
P0750 BeyoGel™ Tricine SDS Sample Buffer (2X) 2ml/10ml
P0751 BeyoGel™ Tricine-SDS Cathode Running Buffer (10X) 100ml/500ml
P0752 BeyoGel™ Tricine-SDS Anode Running Buffer (10X) 100ml/500ml
ST2767 Tricine (≥99%, Reagent grade) 25g/100g/500g
ST2768 Tricine (≥99%, Reagent grade) 25g/100g/500g
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