使用说明：
1. 缓冲液的准备。
参考下表，根据具体的实验用途配制相应的缓冲液。

Buffer	Components	Products from Beyotime
Binding Buffer	20mM Tris-HCl (pH8.0)	1M Tris-HCl, pH8.0 (ST780/ST787) 5M NaCl (ST347/ST348)
Elution Buffer	20mM Tris-HCl (pH8.0), 500mM NaCl

注1：所用水和缓冲液在使用之前建议用0.22μm或0.45μm孔径滤膜过滤，以减少杂质，提高蛋白纯化效率。
注2：推荐的缓冲液适用于大多数蛋白的纯化，也可根据蛋白的稳定性或其自身特点更换其它缓冲体系。对于特殊样品，需自行进行优化，基本原则是低盐浓度上样，高盐浓度洗脱。
注3：对于与本产品结合比较紧密的目的蛋白，可适当地将Elution Buffer中NaCl浓度提高至1M。
2. 填料用量计算。
a. 计算装柱所需层析介质体积Vm (充分沉降后层析介质部分的实体积)，计算公式：
Vm=层析柱横截面积×计划装柱的柱床高度×层析介质的压缩比
注：DEAE琼脂糖凝胶的压缩比为1.15。若是直接纯化，Vm为根据载量计算得到的实体积，无须考虑压缩比。
b. 计算所需DEAE琼脂糖凝胶悬液体积。根据计算得到的Vm计算需要量取的介质悬液体积，计算公式：
DEAE琼脂糖凝胶悬液体积= Vm÷介质悬液浓度
注：DEAE琼脂糖凝胶悬液浓度为50%。
3. 蛋白样品的准备。
蛋白样品必须处在低盐溶液中，否则会影响其与填料的结合。通常推荐把蛋白样品透析至Binding Buffer中，也可以使用脱盐柱进行脱盐处理，或者使用适当孔径的超滤膜以通过超滤去除盐离子。如果样品中盐离子浓度不太高而蛋白浓度比较高，也可以酌情考虑使用Binding Buffer适当进行稀释。为防止样品堵塞柱子，在上样前样品需要用0.45μm的微孔滤膜过滤。
4. DEAE琼脂糖凝胶非装柱的离心式直接纯化。
DEAE琼脂糖凝胶的使用有两种方式。一种是非装柱的离心式直接纯化(本步骤)，即按照DEAE琼脂糖凝胶的载量，量取合适的体积和目的蛋白通过混合孵育和离心的方式进行目的蛋白的纯化，通常适合少量样品的纯化；另一种是比较常见的装柱后进行目的蛋白的纯化(步骤5)。
a. 量取琼脂糖凝胶。重悬DEAE琼脂糖凝胶，混合均匀，取根据步骤2计算所需要的悬液体积如20-100μl置于1.5ml离心管(FTUB306)中待用。注：使用大孔径吸头(如用剪刀剪去部分吸头)吸取凝胶悬浊液会比较方便。
b. 洗涤琼脂糖凝胶。加入Binding Buffer至最终体积为约0.5ml，轻轻重悬DEAE琼脂糖凝胶。600×g在4ºC离心5分钟，小心去除上清，不要吸到凝胶，完成一次洗涤步骤。然后再按照前述洗涤步骤，洗涤2次。最终去除上清，并根据后续的实验目的，用适量的适当溶液重悬DEAE琼脂糖凝胶。
c. 蛋白吸附。加入适量处于Binding Buffer中的目的蛋白，轻轻重悬DEAE琼脂糖凝胶，置于翘板式摇床或旋转混合仪上，室温孵育30-60分钟。注：如果需要，可以在2-8ºC混合1小时，以防止目标蛋白降解。推荐使用BeyoShaker™数字式翘板摇床(E6673)。
d. 去除上清。600×g在4ºC离心5分钟，去除上清，不要吸到凝胶。这一步骤的上清可以保留，以便于检测目标蛋白的结合效果，甚至在出现结合效果不太理想的情况下，对于回收的上清可以再次用于纯化。
e. 洗涤。取1ml Binding Buffer加入DEAE琼脂糖凝胶中，轻轻重悬DEAE琼脂糖凝胶，600×g在4ºC离心5分钟，去除上清，不要吸到凝胶。再重复洗涤3次。
f. 洗脱。根据目标蛋白的浓度及后续实验要求，加入100-200μl Elution Buffer，轻轻颠倒离心管数次，摇床摇动洗脱10分钟，置于离心机中600×g在4ºC离心5分钟，收集洗脱液转移到新的离心管中，即为目标蛋白。
5. DEAE琼脂糖凝胶装柱(本步骤为装柱使用方法，仅供参考，可根据实际情况或已有经验进行调整)。
a. 装柱。
(a) 取根据步骤2计算所需要的悬液体积，采用砂芯漏斗将所取的琼脂糖凝胶抽干，加入Binding Buffer (琼脂糖沉淀体积：Binding Buffer=1:1)重悬DEAE琼脂糖凝胶，形成均匀的凝胶悬浊液，并进行脱气处理。脱气推荐碧云天的BeyoSonicator™数字加热型超声波清洗仪(E6900/E6903/E6906)。
(b) 将层析柱垂直固定，使其底端浸没在盛有适量超纯水或者Equilibration Buffer的适当容器的液面下并保持一段液位。推荐碧云天的1ml (FCL01)、3ml (FCL03)、6ml (FCL06)、12ml (FCL12)等亲和层析柱空柱管。
(c) 将步骤5a的琼脂糖悬液用玻璃棒引导沿着柱内壁一次性全部倒入层析柱内，用塞子堵住层析柱底部，静置过夜，使凝胶自由沉降至底部。
注：所有操作过程不能引入气泡，保证装入填料的均匀度。
b. 平衡。
(a) 连接好柱子顶端的活动柱头与蠕动泵，打开蠕动泵，先用5倍柱体积Binding Buffer以上样操作时的流速平衡层析柱，再用5倍柱体积Binding Buffer以上样操作时1.5倍的流速平衡层析柱。
(b) 调节适配柱头，使其尽量贴近胶面，最后用2~3倍柱体积的Binding Buffer以上样操作时的流速平衡柱子，观察检测器的变化，直到电导、pH等参数稳定不变。
c. 上样。
(a) 对于处于Binding Buffer中的目的蛋白样品，切换转换阀进行蛋白上样，把样品从层析柱的上端加入，建议操作流速为300-600cm/h，这样能保证目的蛋白与琼脂糖凝胶充分接触，提高目的蛋白的回收率。
(b) 同时收集穿流液(Flow-through)，待检测。为了获得更好的目的蛋白结合效果可将穿流液再上样，重复步骤5c(a) 2次(或将样品1次性加入层析柱后置于摇床上，轻轻摇动，结合30分钟)。
注1：上样量根据样品的性质和层析介质的量进行选择，也可进行预实验找到最佳上样量。
注2：样品的预处理：除盐，用Binding Buffer透析或稀释，0.45μm孔微孔滤膜过滤。
d. 洗涤。
(a) 样品结合后，用2~3个柱体积的Binding Buffer洗涤上样后的层析柱，除去未交换结合的组分，观察检测器的变化，直到电导、pH等参数不变。
(b) 用约20倍柱体积的Binding buffer洗涤层析柱以去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗涤液。洗涤过程中勿让层析柱滴干。洗涤是否完全可以通过测定收集的洗涤液的280nm吸光度，最后的洗涤液的吸光度应该和Binding Buffer的吸光度或通过色谱系统测定紫外吸收达到一个稳定的基线而确定。
e. 洗脱。
可用恒定洗脱、线性梯度洗脱或者步级梯度洗脱。根据目标蛋白的浓度及后续实验要求，推荐使用Elution Buffer进行洗脱。通常按5倍柱体积的Elution buffer洗脱结合的目标蛋白。收集洗脱液，每管0.5ml-1ml (对于1ml层析柱)。
f. 再生。
(a) 按操作速度用3~5倍柱体积的高盐浓度的缓冲液(20mM Tris-HCl (pH8.0), 1-2M NaCl)冲洗层析柱。
(b) 接着用3~5倍柱体积的Equilibration Buffer洗涤层析柱。
注：若有失活蛋白质或脂类物质在再生时洗不掉，可用在位清洗(CIP)除去。
g. 在位清洗(Cleaning-in-place/CIP)。
(a) 介质经过长期使用后，过多的污染物会使柱床反压增大，从而降低柱效与介质吸附载量，甚至损害介质的寿命。定期在位清洗可有效保护介质。如果介质轻微污染，可每1-5次循环进行一次在位清洗。
(b) 对于实验后污染严重的介质，必须立即进行CIP处理。针对不同类型的杂质和污染物可按下述方法进行在位清洗：
1）结合比较紧密蛋白的去除。用2~3倍柱体积的2M NaCl清洗，去除结合紧密的蛋白。
2）强疏水性蛋白、沉淀蛋白的去除。先用3~5倍柱体积的1M NaOH清洗层析柱，去除沉淀蛋白和疏水结合蛋白，然后立即用5~10倍柱体积的超纯水清洗。
3）脂蛋白和脂类物质的去除。先用5~10倍柱体积的70%乙醇或30%异丙醇清洗，然后用5~10倍柱体积的超纯水清洗。
4）也可以将上述两种清洗条件结合进行清洗，如用含有1M NaOH的30%异丙醇溶液清洗。
注：70%乙醇或30%异丙醇使用前应进行超声波脱气处理；在位清洗过程中流速可选30-60cm/h；堵塞严重的时候可以进行反向清洗。
6. 灭菌。
由于20%乙醇不具有杀菌、除热原作用，建议DEAE Agarose 6FF介质在使用前及使用过程中，使用1M NaOH处理0.5-1小时以减少微生物污染风险。
7. 保存。
DEAE Agarose 6FF使用20%乙醇为保存液。使用后的DEAE Agarose 6FF应储存于20%乙醇中、4ºC密闭保存。为了防止乙醇挥发以及微生物滋生，如有必要可以每3个月更换一次新鲜的保存液。
参考文献：
1. Kopaciewicz W, Regnier FE. Analytical Biochemistry. 1983. 133(1):251-259.
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产品编号	产品名称	包装
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P2019	Protein A+G Agarose (Fast Flow, 抗体纯化用)	2/10/50/200ml
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P2069	CM Agarose 6FF (CM琼脂糖凝胶)	10/50/200/1000ml
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P2165	Heparin Agarose (肝素琼脂糖凝胶)	1/5/20ml
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FCL03	亲和层析柱空柱管(3毫升)	20套/包
FCL06	亲和层析柱空柱管(6毫升)	20套/包
FCL12	亲和层析柱空柱管(12毫升)	20套/包
FCL30	亲和层析柱空柱管(30毫升)	10套/包
FCL60	亲和层析柱空柱管(60毫升)	10套/包