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| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 | 产品价格 |
| PC160 | Human CCL5/RANTES ELISA Kit | 96次 | 3198.00元 |
碧云天的Human CCL5/RANTES ELISA Kit (Human Regulated upon Activation, Normal T cell Expressed and
presumably Secreted, RANTES Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Kit)，即人趋化因子蛋白RANTES酶联免疫吸附检测试剂盒，是一种用于特异性地高灵敏地定量检测人血清、血浆或细胞培养上清液中的CCL5/RANTES的ELISA试剂盒。
本产品检测灵敏度高，特异性强，重复性好。多次重复检测结果表明，最小检出量为34pg/ml，与人ANG 、EGF 、Epo 、FGF acidic 、HGF、 IFN-γ、 FGF basic，小鼠CCL5等均没有交叉反应，板内、板间变异系数均小于10%。
RANTES (Regulated upon Activation, Normal T cell Expressed and presumably Secreted)又称趋化因子5 (Chemokine C-C motif Ligand, CCL5)，是趋化因子CC亚族的成员之一。RANTES能够对淋巴细胞产生趋化作用，并调节其功能，从而在炎性免疫反应中具有重要作用。人RANTES的cDNA编码产生91个氨基酸的前体蛋白，其中包括23个氨基酸的疏水信号肽，信号肽裂解后得到68个氨基酸的成熟蛋白。人RANTES与小鼠RANTES大约具有85%的氨基酸同源性。
RANTES对多种细胞都具有化学趋化作用，例如未激活的(CD4+/CD45RO+)记忆T细胞和活化的CD4+、CD8+T细胞、自然杀伤细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞、肥大细胞、单核细胞和小神经胶质细胞等。除了影响细胞迁移外，RANTES还能激活多种细胞，包括T细胞、单核细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、树突状细胞和星形胶质细胞等。T细胞的激活通常需要相对较高的RANTES浓度(~1μM)，并且需要小分子的聚集和细胞表面粘多糖的参与。
RANTES能够与CCR1、CCR3、CCR4、CCR5等4种G蛋白偶联受体作用。RANTES能够激活多种信号通路，例如在T细胞中，RANTES能够刺激细胞内Ca2+浓度升高，激活FAK、PKA、PI3K等多种蛋白激酶和JAK/STAT信号通路。巨细胞病毒US28与CC趋化因子受体具有高度同源性，也能够与RANTES结合。在不同细胞环境下，跨膜的US28能够与RANTES结合激活G蛋白偶联受体介导的下游信号，或者阻断RANTES从而改变炎性应答反应。在RANTES4种受体中，CCR5同样也能够与HIV-1的变体结合，因此RANTES、MIP-1α和MIP-1β作为CCR5的配体能够竞争性抑制CCR5/HIV-1的相互作用，在体外抑制HIV-1感染。
本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法(Sandwich ELISA)检测样品中人CCL5/RANTES的浓度，其原理见图1。人CCL5/RANTES特异的单克隆捕获抗体已预包被于酶标板上，当加入标准品或样品时，其中的人CCL5/RANTES会与捕获抗体结合。当加入生物素化的抗人CCL5/RANTES抗体后，生物素化抗人CCL5/RANTES抗体与人CCL5/RANTES结合，形成夹心的免疫复合物。随后加入辣根过氧化物酶标记Streptavidin (HRP-Streptavidin)，由于生物素与链霉亲和素(Streptavidin)可以特异性地结合，因此链霉亲和素连接的HRP就会与夹心的免疫复合物连接起来而被固相捕获。最后加入显色剂TMB溶液，固相捕获的辣根过氧化物酶就会催化无色的显色剂氧化成蓝色物质，在加入终止液后呈黄色。通过酶标仪检测450nm处的吸光度值就能实现定量检测。人CCL5/RANTES浓度与A450值呈正比，通过绘制标准曲线，对照样品吸光度值，即可计算出样品中人CCL5/RANTES浓度。
图1. 双抗体夹心ELISA原理图。
一个包装的本试剂盒，包括标准品检测，可以进行96次检测。
包装清单：
| 产品编号 | 产品名称 | 包装 |
| PC160-1 | 人CCL5/RANTES抗体预包被板 | 8孔×12条 |
| PC160-2 | 样品分析缓冲液 | 5ml |
| PC160-3 | 标准品稀释液(5X) | 20ml |
| PC160-4 | 人CCL5/RANTES标准品 | 2-4瓶 |
| PC160-5 | 人CCL5/RANTES生物素化抗体 | 10ml |
| PC160-6 | 辣根过氧化物酶标记Streptavidin | 10ml |
| PC160-7 | 洗涤液(20X) | 30ml |
| PC160-8 | TMB溶液 | 10ml |
| PC160-9 | 终止液 | 5ml |
| PC160-10 | 封板膜(透明) | 2张 |
| PC160-11 | 封板膜(白色) | 2张 |
| - | 说明书 | 1份 |
使用说明：
1.样品准备
a. 样品的准备请按下列流程进行操作：
(a)细胞上清样品离心取上清即可(如100-500g，5分钟)。
(b)对于血清样品，将全血在室温下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃约1000-2000g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀。制备好的血清需置于冰上待用。
(c)对于血浆样品，采集的全血建议使用EDTA进行抗凝处理，混匀后置冰上，4℃约1000-2000g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。制备好的血浆需置于冰上待用。
(d)若待测样品不能及时检测，样品制备后请分装，冻存于-20℃或-80℃，并注意避免反复冻融。
b.血清样品不应添加任何防腐剂或抗凝剂。
c.样品应清澈透明，检测前样品中如有悬浮物应通过离心去除。
d.请勿使用溶血、高血脂或污染的样品检测，否则结果将不准确。
注：血清或血浆样品需要用1X标准品稀释液适当稀释后再检测。
2.检测前准备工作
a.试剂盒从冰箱中取出后应置室温(25-28℃)平衡20分钟；每次检测后剩余试剂请及时置于4℃保存。
b.配制适当量的标准品稀释液：将标准品稀释液(5X)用双蒸水或去离子水稀释至1X，例如10ml标准品稀释液(5X)加40ml水混匀后即为1X标准品稀释液。
c.配制适当量的洗涤液：将洗涤液(20X)用双蒸水或去离子水稀释至1X，例如10ml洗涤液(20X)加190ml水混匀后即为1X的洗涤液。
d.按标准品标签上标注的体积加入标准品稀释液至1瓶标准品中，室温孵育15分钟(为确保标准曲线的准确性，切勿缩短孵育时间)。随后轻轻混匀并用移液枪吹打几次使标准品彻底溶解，使标准品终浓度达到1000pg/ml。通常每个浓度的标准品需要检测2个孔，每个孔的标准品用量为100μl，共需200μl，同时稀释时还需要使用250μl，因此如果1瓶标准品配制后的体积不足0.45ml，请使用更多瓶数的标准品，并在合并混匀后使用。
e.取5个洁净的1.5毫升离心管，每管预先分别加入60μl、120μl、150μl、180μl、210μl和225μl的标准品稀释液，随后参考下表补加相应体积1000pg/ml的标准品，使得每管溶液稀释后的体积均为240μl，最终得到1000、750、500、375、250、125、62.5pg/ml共七个标准品浓度，最后将稀释好的标准品依次加入预包被板孔中，标准品稀释液直接加入作为0pg/ml浓度，共八个标准品浓度[制作网页时请注意变化]。
| 标准品终浓度(pg/ml) | 1X标准品稀释液加入体积(μl) | 标准品原液加入体积(μl) |
| 750 | 60 | 180 |
| 500 | 120 | 120 |
| 375 | 150 | 90 |
| 250 | 180 | 60 |
| 125 | 210 | 30 |
| 62.5 | 225 | 15 |
3.洗涤方法
自动洗板机或手工洗板：每孔洗涤液为300μl，注入与吸出间隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后将板倒扣在厚吸水纸上适当用力拍干。
4.实验过程需自备的材料和仪器
a.不同规格的移液枪及相应的吸头
b.酶标仪
c.自动洗板机(如果没有也可以手工洗板)
d.去离子水或双蒸水
5.操作步骤
a.计算并确定一次实验所需的预包被板条数，取出所需板条放置在96孔框架内，暂时用不到板条请放回铝箔袋密封，保存于4℃。
b.每次实验都需配制标准品并绘制出标准曲线，同时建议设置本底较正孔，即空白孔，设置方法为该孔只加TMB溶液和终止液。
c.分别将样品或不同浓度标准品按照100μl/孔加入相应孔中，用封板膜(透明)封住反应孔，室温孵育120分钟。对于血清样品的CCL5/RANTES的检测，不同样品稀释比例有所区别，一般范围在20-80倍，如无明确范围，建议从20倍开始稀释，加样稀释时，先加入样品分析缓冲液50μl/孔，再加入50μl用1X标准品稀释液稀释后的样品；不推荐使用血浆样品，如果是血浆样品的CCL5/RANTES的检测，建议从2倍开始稀释，加样稀释时，先加入样品分析缓冲液50μl/孔，再加入50μl用1X标准品稀释液稀释后的样品；细胞上清样品的CCL5/RANTES的检测需根据实验结果确定稀释范围。对于血清血浆样本，如果样品浓度过高超过检测范围，请加大稀释倍数后重新稀释检测。请注意记录好样品的稀释倍数。
注意：请先查阅相关文献确定样品中待检测蛋白的大致浓度，如果该浓度大于或者小于本试剂盒的最高或者最低标准品浓度，请适当稀释或浓缩后再进行检测。
d.洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
e.加入生物素化抗体100μl/孔(注：此生物素化抗体已经预先配制好，可以直接使用，不必再进行稀释)。用封板膜(透明)封住反应孔，室温孵育60分钟。
f.洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
g.加入辣根过氧化物酶标记Streptavidin 100μl/孔(注：此辣根过氧化物酶标记Streptavidin已经预先配制好，可以直接使用，不必再进行稀释)。用封板膜(白色)封住反应孔，室温避光孵育20分钟。室温偏低时(低于25℃)，需要适当延长孵育时间。
h.洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干。
i.加入显色剂TMB溶液100μl/孔，用封板膜(白色)封住反应孔，室温避光孵育4-6分钟。因为反应速度非常快，此步骤建议使用排枪加入TMB溶液。室温偏低时需要适当延长孵育时间，此时可以孵育至标准品出现非常显著的颜色变化，若样品浓度足够高也会出现显著的颜色变化。
j.加入终止液50μl/孔，混匀后立即测量A450值。
6.结果分析
a.复孔的值通常在20%的差异范围内结果才有效，复孔平均值可作为测量值。
b.每个标准品或样品的吸光度值应减去本底校正孔的吸光度值(如果没有做校正孔，则不需要减去)。
c.绘制标准曲线。以标准品浓度为横坐标，A450值为纵坐标，以平滑线连接各标准品的坐标点。通过样品的吸光度值和标准曲线计算出样品的相应浓度。
图3. Human CCL5/RANTES ELISA Kit的标准曲线。实测数据会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。
d.若样品OD值高于标准曲线上限，应适当稀释后重新测定，计算浓度时需注意乘以样品的稀释倍数。
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