订货电话
400-1683301
800-8283301
电话订货时间:
周一到周五9:00-17:00
订货邮件
order@beyotime.com
订货QQ
4001683301
微信在线咨询
订单下载
碧云天订单.xls
信号转导> 信号小分子检测> 代谢小分子相关
G6PDH活性检测试剂盒(WST-8法)
产品编号: S0189
产品包装:100次
选择包装
价格:¥1352.00元
产品简介
使用说明
产品图片
相关产品
相关论文
产品问答
产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
S0189 G6PDH活性检测试剂盒(WST-8法) 100次 1352.00元

碧云天的G6PDH活性检测试剂盒(WST-8法) (G6PDH Activity Assay Kit with WST-8)是一种高灵敏度的基于WST-8的显色反应,通过比色法来检测细胞、组织或其它样品中G6PDH (glucose-6-phosphate dehydrogenase)酶活性的检测试剂盒。
WST-8是MTT的一种升级替代产品,和MTT或其他MTT类似产品如XTT、MTS等相比有明显的优点。首先,MTT被一些脱氢酶还原生成的formazan不是水溶性的,需要有特定的溶解液来溶解;而WST-8和XTT、MTS产生的formazan都是水溶性的,可以省去后续的溶解步骤。其次,WST-8产生的formazan比XTT和MTS产生的formazan更易溶解。再次,WST-8比XTT和MTS更加稳定,使实验结果更加稳定。另外,WST-8和MTT、XTT等相比,线性范围更宽,灵敏度更高。WST-8和WST-1相比,检测灵敏度更高,更易溶解,并且更加稳定。
本试剂盒使用便捷。使用细胞、组织等的裂解液即可进行检测,无需分离纯化细胞、组织或其它样品中的G6PDH。
本试剂盒检测灵敏度高,线性范围宽。可以每孔含量低至0.05mU的G6PDH,在1mU/ml (0.05mU/孔)至100mU/ml (5mU/孔)之间呈现良好的线性关系。
葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,简称G6PDH或G6PD)可催化葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate,G6P)转化为6-磷酸葡萄糖酸内脂(6-phosphogluconate, 6-PG),这是磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway, PPP)的第一个步骤,也是该途径的限速步骤。磷酸戊糖途径对于NADPH (还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸,也称为还原型辅酶II)和戊糖的生成至关重要。NADPH对于通过GSH的再生来调控氧化还原平衡以及脂肪酸生物合成来说都至关重要。所以G6PDH的缺乏会导致由于不能生成NADPH而引起的一些疾病,如新生儿黄疸、非免疫性溶血性贫血等。
本试剂盒可检测样品中的G6PDH的酶活性,具体原理如下:G6P在G6PDH的作用下氧化生成6-PG,在这一反应过程中NADP+被还原为NADPH,生成的NADPH在电子耦合试剂1-mPMS (1-Methoxy-5-methylphenazinium Methyl Sulfate)的作用下将WST-8还原生成橙黄色的formazan,在450nm左右有最大吸收峰。反应体系中生成的formazan与样品中G6PDH的活性呈正比关系。WST-8法检测G6PDH的原理参考图1。

图1.WST-8法检测G6PDH酶活性的原理图。

本试剂盒适用于检测细胞、组织以及其它适当样品(如血液、血清)中的G6PDH活性。
本试剂盒可以测定100个样品。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
S0189-1 反应缓冲液 5.5ml
S0189-2 G6PDH底物 220μl
S0189-3 显色液 220μl
S0189-4 G6PDH(0.25U/μl) 25μl
S0189-5 G6PDH提取液 50ml
说明书 1份

保存条件:
-20℃保存,一年有效。显色液(S0189-3)须-20℃避光保存。
注意事项:
经检测本试剂盒中的G6PDH (细菌来源)室温存放72小时或反复冻融5次不影响其酶活性。但对于不同物种的G6PDH是否能耐受长时间的室温存放或反复冻融须自行测试,初次检测时尽量使用新鲜制备的样品。
由于G6PDH提取液本身略显粘稠,以该提取液作为稀释液时,无论对标准品还是样品进行稀释,在稀释过程中务必确保稀释均匀,否则易造成实验数据产生较大波动。
在样品加样和混匀过程中,须尽量避免产生气泡,以免影响最终的吸光度测定。
如果需要测定样品中G6PDH的绝对活力而又不能非常严格地控制反应温度和反应时间,则每次检测都需要设置标准曲线。
如果样品溶液中G6PDH活性过高或过低,不在试剂盒的线性检测范围内时,可适当调整样品或者提取液的用量。
本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1. 样品的准备:
a. G6PDH提取液室温或37℃水浴解冻,解冻后置于冰浴。如果37℃水浴解冻,须注意解冻后立即置于冰浴。
b. 细胞样品的准备:对于贴壁细胞,约1×106个细胞(大约相当于6孔板一个孔长满的细胞数量),吸净培养液,用移液器加入200μl的冰浴预冷的G6PDH提取液,并轻轻吹打,以促进细胞的裂解;对于悬浮细胞,收集约1×106个细胞,600g离心5分钟,吸净培养液,用移液器加入200μl冰浴预冷的G6PDH提取液,并轻轻吹打,以促进细胞的裂解。随后12,000g,4℃离心5-10分钟,取上清作为待测样品,冰浴存放备用。注:裂解过程在冰上或室温操作均可,但以冰浴操作为佳,可以有效减少内源性蛋白酶等导致的酶活性下降。
c. 组织样品的准备:冰浴预冷的PBS洗涤组织后,称取约10-30mg的组织样品,用剪刀剪碎,置于匀浆器中,加入400μl的冰浴预冷的G6PDH提取液在冰上或室温进行匀浆。随后12,000g,4℃离心5-10分钟,取上清作为待测样品,冰浴存放备用。注:匀浆过程在冰上或室温操作均可,但以冰浴操作为佳,可以有效减少内源性蛋白酶等导致的酶活性下降。
2. 试剂盒的准备工作:
a. G6PDH标准品的配制:取4μl G6PDH (0.25U/μl,即250U/ml)和996μl G6PDH提取液混匀即为1U/ml G6PDH标准品。注意:稀释后的G6PDH不太稳定,配制后宜尽快使用。
b. G6PDH标准曲线的设置:取200μl G6PDH标准品(1U/ml)用G6PDH提取液3倍系列稀释(serial dilution)成适当的浓度梯度,如初次检测可以设置0、1.37、4.1、12.3、37、111、333、1000mU/ml这几个浓度,检测时96孔板每孔加入50μl的标准品,相当于每孔加入的G6PDH的酶量为0、0.069、0.21、0.62、1.85、5.56、16.7、50mU。如有必要,在后续的实验中可以根据样品中的G6PDH活性对标准品的浓度范围进行适当调整。其中浓度为0mU/ml的标准品为空白对照 (Blank),仅含G6PDH提取液。
c. G6PDH检测液的配制:样品中的NADPH等可能会产生一定的背景,建议设置加入样品而不加入G6PDH底物的背景对照;对于标准品和样品的G6PDH检测液,需要加入G6PDH底物。每个背景对照、标准品或样品的检测需要使用50μl的G6PDH检测液,请根据所需检测的背景对照、标准品和样品的数量,配制适量的G6PDH检测液,并注意现配现用。G6PDH检测液的配制方法如下:

G6PDH检测液(背景对照) G6PDH检测液(标准品或样品)
反应缓冲液 48μl 46μl
显色液 2μl 2μl
G6PDH底物 2μl

3. 样品测定:
a. 样品G6PDH活性的测定:吸取50μl待测样品或标准品至96孔板中,为了减少实验误差建议设置样品的重复孔。后续如果发现样品中的G6PDH活性过高,超过标准品的线性检测范围,则需要用G6PDH提取液将样品适当稀释后再进行检测;活性过低时则需要加大细胞或组织样品的用量。
b. 每孔加入50μl G6PDH检测液到样品或标准品孔,适当混匀。背景对照孔需要加入50μl不含G6PDH底物的G6PDH检测液。在加入G6PDH检测液的过程中须轻柔操作,以免产生气泡。若不慎出现气泡,可使用细小的吸头或针头戳破。特别注意:如果样品中的NADPH等产生的背景比较高,就必须设置背景对照;初次检测宜设置背景对照。
c. 37℃避光孵育10分钟,此时会形成橙黄色的formazan。测量450nm处的吸光度,如果显色较浅,也可以适当延长孵育时间至15-30分钟,随着孵育时间的延长显色会越来越深。
4. 样品中G6PDH活性的计算:
a. 将标准品和样品的吸光度减去标准品浓度为0mU/ml的空白对照(Blank)吸光度。同时,如果背景对照(Background)的吸光度比较高,需要再将所有样品的吸光度减去各自的背景对照的吸光度。
b. 以G6PDH酶活性为横坐标,吸光度为纵坐标,绘制出标准曲线。G6PDH标准品的检测效果请参考图2。

图2. 本试剂盒检测G6PDH的标准曲线。图中G6PDH的浓度分别0、1.37、4.1、12.3、37、111mU/ml,反应时间为30分钟。如果适当缩短反应时间,可以在0-1000mU/ml的范围内呈现良好的线性关系。不同的检测条件下,实际读数会因标准品的配制、检测仪器等的不同而存在差异,图中数据仅供参考。

c. 根据标准曲线计算细胞、组织等样品中的G6PDH活性。
备注:根据检测得到的活性及样品的体积,即可计算出G6PDH的活力单位。
d. 如果希望更加精确地来表述G6PDH的酶活力,可以将G6PDH提取液制备的细胞或组织样品用BCA法测定蛋白浓度。最终用单位蛋白量中G6PDH的活力单位来比较精确地进行表述。

相关产品请点击如下按钮:
使用本产品的文献:
购物车
会员
顶部