使用说明：
1.样品的准备：
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g, 5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每20-100万细胞加入100-200μl的比例加入异丙醇，适当吹打。对于贴壁细胞适当吹打使细胞脱离培养器皿并转移至离心管中。对于组织样品，按照每10-20mg组织加入100-200μl的比例加入异丙醇。对于培养的细胞和组织，推荐把体积控制在100-200μl使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆；也可以考虑把体积放大到400-500μl左右，采用瓷珠机械震荡的方式进行匀浆；或者也可以使用常规的玻璃匀浆器进行匀浆(建议尽量使用较小的玻璃匀浆器，以便于把样品的体积控制在较小体积范围内)。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。
注1：异丙醇制备的样品使用检测缓冲液至少稀释5倍后(即50μl待测样品中异丙醇的含量不高于20%)再用于后续检测。
注2：以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
注3：异丙醇容易挥发，由于操作时间过长导致异丙醇的挥发，后续可以将异丙醇补足至初始体积，然后再进行样品的检测；所有样品的挥发程度接近的情况下，可以统一不再补足挥发掉的异丙醇，但计算样品中的浓度时需要考虑到挥发掉的异丙醇的体积。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接吸取培养液；对于悬浮细胞，离心后吸取培养液。
2.试剂盒的准备：
a.融解甘油标准溶液(10mM)和检测缓冲液，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.甘油检测工作液(Working Solution)的配制：按照每个检测反应80μl的体积配制适量的甘油检测工作液。均匀混合72μl检测缓冲液(Glycerol Assay Buffer)、2μl Amplex Red、2μl甘油激酶(Glycerol Kinase)、2μl酶混合物(Enzyme Mix)、2μl Cofactor，即可配制成80μl甘油检测工作液。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的甘油检测工作液。具体配制方法参考下表。配制好的检测工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	10	20	50
Glycerol Assay Buffer (μl)	72	720	1440	3600
Amplex Red (μl)	2	20	40	100
Glycerol Kinase (μl)	2	20	40	100
Enzyme Mix (μl)	2	20	40	100
Cofactor (μl)	2	20	40	100
Working Solution (μl)	80	800	1600	4000

注：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
3.样品测定：
a.甘油标准曲线设置(吸光度检测或荧光检测，可选取其中的一种，对于样品量较少的情况，优先推荐采用荧光检测)
(a)吸光度检测：取10μl甘油标准溶液(10mM)，加入190μl检测缓冲液(如果检测异丙醇制备的细胞或组织样品，也可以更加精准地使用和样品中异丙醇含量相同的检测缓冲液，但20μl标准品中异丙醇的含量不得超过50%)，混匀，配制成浓度为500μM的甘油标准溶液。分别取500μM的甘油标准溶液0、4、8、12、16、20μl加入96孔板的标准品孔中，并用检测缓冲液或含适量异丙醇的检测缓冲液补足到20μl，此时，标准曲线的浓度分别为0、100、200、300、400、500μM。
注：吸光度检测时建议使用透明96孔板(FPT010/FPT011)。
(b)荧光检测：取4μl甘油标准溶液(10mM)，加入196μl检测缓冲液(如果检测异丙醇制备的细胞或组织样品，也可以更加精准地使用和样品中异丙醇含量相同的检测缓冲液，但20μl标准品中异丙醇的含量不得超过50%)，混匀，配制成浓度为200μM的甘油标准溶液。分别取200μM的甘油标准溶液0、1、2、5、10、20μl加入96孔板的标准品孔中，并用检测缓冲液或含适量异丙醇的检测缓冲液补足到20μl，此时，标准曲线的浓度分别为0、10、20、50、100、200μM。
注：荧光检测时建议使用96孔黑板(FCP965/FCP966)。
b.加入1-20μl稀释后的样品到96孔板样品孔中，并相应地再加入检测缓冲液至样品孔中，补足到20μl。同时设置仅含检测缓冲液或含适量异丙醇的检测缓冲液的孔为空白对照。
注：为确保数值在标准曲线范围内，建议将样品同时设定多个稀释倍数。可以进行预实验确定样品的大致浓度，如果数值不在标准曲线范围内，请调整样品的稀释倍数或者样品的量。样品总稀释倍数记录为n (包括步骤1b中的稀释倍数。例如1b中的稀释倍数为5，本步骤中又对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为4µl，则n=5×10×20/4=250)。注意：用异丙醇制备的细胞或组织样品，检测时20µl样品中的异丙醇含量不能超过50%，即相当于最终检测体系中的浓度不会超过10%。
c.(选做)甘油-3-磷酸或过氧化氢的存在会对甘油的检测产生干扰，如果样品中含有甘油-3-磷酸或过氧化氢，须同时设置样品背景对照孔，具体设置方法同步骤3b，并在步骤3d时不加入步骤2b正常配制的甘油检测工作液，而是加入未添加甘油激酶(用相同体积的检测缓冲液替代甘油激酶)的“甘油检测工作液”。
d.每孔加入甘油检测工作液80μl，混匀，37ºC避光反应30分钟。
注1：如果样品中甘油的含量较高，可适当缩短反应时间，例如反应15或20分钟；如果由于样品中甘油含量偏低而导致吸光度偏低或荧光偏弱，可适当延长反应时间，例如反应60或90分钟，此时检测灵敏度会提高，但标准曲线的高浓度孔会超出线性范围，对于不在线性范围的高浓度点在计算时可以舍去。
注2：样品背景对照孔请加入未添加甘油激酶(用相同体积的检测缓冲液替代甘油激酶)的“甘油检测工作液”。
e.如果使用吸光度检测，测定A570；如果使用荧光检测，设置激发波长为560nm，发射波长为590nm进行荧光强度检测。
f.建立标准曲线，并计算样品中甘油的浓度(A)，如果样品的背景对照孔信号比较高，样品的信号值需要减去样品背景对照值。甘油标准曲线可以参考图2，吸光度检测在20-500μM浓度范围内有良好的线性关系，荧光检测在2-200μM浓度范围内有良好的线性关系。甘油浓度的计算公式如下：
C (μM) = A × n
注：A为步骤3f根据标准曲线确定的甘油浓度(μM)；
n为样品步骤3b中提及的样品总稀释倍数。
也可以根据甘油的分子量92.09计算出质量浓度(μg/ml) = C × 0.09209。
参考文献：
1.Robergs RA, Griffin SE. Sports Med. 1998. 26(3):145-67.
2.Hagström-Toft E, Enoksson S, Moberg E, Bolinder J, Arner P. Am J Physiol. 1997. 273(3 Pt 1):E584-92.
3.Nurjhan N, Kennedy F, Consoli A, Martin C, Miles J, et al. Metabolism. 1988. 37(4):386-9.
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