使用说明:
1. 探针的标记:
(1)如下设置探针标记的反应体系: |
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待标记探针(1.75pmol/μl) |
2μl |
T4 Polynucleotide Kinase Buffer(10X) |
1μl |
Nuclease-Free Water |
5μl |
[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) |
1μl |
T4 Polynucleotide Kinase(5-10u/μl) |
1μl |
总体积 |
10μl |
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按照上述反应体系依次加入各种试剂,加入同位素后,Vortex混匀,再加入T4 Polynucleotide
Kinase,混匀。
(2)使用水浴或PCR仪,37℃反应10分钟。
(3)加入1微升探针标记终止液,混匀,终止探针标记反应。
(4)再加入89微升TE,混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上,
即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见,通常不必测定探针的标记效率。
(5)标记好的探针最好立即使用,最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。
2. 探针的纯化:
通常为实验简便起见,可以不必纯化标记好的探针。在有些时候,纯化后的探针会改善EMSA的电泳结
果。如需纯化,可以按照如下步骤操作:
(1)对于100微升标记好的探针,加入1/4体积即25微升的5M醋酸铵,再加入2体积即200微升的无水乙
醇,混匀。
(2)在-70℃至-80℃沉淀1小时,或在-20℃沉淀过夜。
(3)在4℃,12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清,切不可触及沉淀。
(4)在4℃,12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀,但不宜过分干燥。
(5)加入100微升TE,完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用,最长使用时间一般不宜超过3天。标
记好的探针可以保存在-20℃。
3. EMSA胶的配制:
(1)准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具,或其它适当的模具。最好选择可以灌
制较薄胶的模具,以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果,可以选择可灌制较大EMSA胶的模
具。
(2)按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝胶(注意:使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响
不大)。 |
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TBE buffer(10X) |
1ml |
重蒸水 |
16.2ml |
39:1 acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v) |
2ml |
80% 甘油 |
625μl |
10% 过硫酸铵(ammonium persulfate) |
150μl |
TEMED |
10μl |
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(3)按照上述次序加入各个溶液,加入TEMED前先混匀,加入TEMED后立即混匀,并马上加入到制胶的模
具中。避免产生气泡,并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡,可以把一块制胶的玻璃板进行
硅烷化处理。
4. EMSA结合反应:
(1)如下设置EMSA结合反应(预期的结果参见图1): |
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阴性对照反应: |
Nuclease-Free Water |
7μl |
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) |
2μl |
细胞核蛋白或纯化的转录因子 |
0μl |
标记好的探针 |
1μl |
总体积 |
10μl |
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样品反应: |
Nuclease-Free Water |
5μl |
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) |
2μl |
细胞核蛋白或纯化的转录因子 |
2μl |
标记好的探针 |
1μl |
总体积 |
10μl |
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探针冷竞争反应: |
Nuclease-Free Water |
4μl |
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) |
2μl |
细胞核蛋白或纯化的转录因子 |
2μl |
未标记的探针 |
1μl |
标记好的探针 |
1μl |
总体积 |
10μl |
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突变探针的冷竞争反应: |
Nuclease-Free Water |
4μl |
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) |
2μl |
细胞核蛋白或纯化的转录因子 |
2μl |
未标记的突变探针 |
1μl |
标记好的探针 |
1μl |
总体积 |
10μl |
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Super-shift反应: |
Nuclease-Free Water |
4μl |
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) |
2μl |
细胞核蛋白或纯化的转录因子 |
2μl |
目的蛋白特异抗体 |
1μl |
标记好的探针 |
1μl |
总体积 |
10μl |
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(2)按照上述顺序依次加入各种试剂,在加入标记好的探针前先混匀,并且室温(20-25℃)放置10分
钟,从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合,或者让冷探针优先反应。然后加入标记好
的探针,混匀,室温(20-25℃)放置20分钟。
(3)加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色,10X),混匀后立即上样。注意:有些时候溴酚蓝会
影响蛋白和DNA的结合,建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样
缓冲液在上样时感觉到无法上样,可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液,
至能观察到蓝颜色即可。
5. 电泳分析:
(1)用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔,
可以加入少量稀释好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色),以观察电压是否正常进行。
(2)把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的
EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色),用于观察电泳进行的情况。
(3)按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃,如果温度升高,需要适当降低电压。电泳至
EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处,停止电泳。
(4)剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板,用吸水纸或
普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注:通常选择先移走硅烷
化的那块玻璃板),把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶,轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被
胶微微浸湿后(大约不足1分钟),轻轻揭起滤纸,这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向
下,放平,在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜,确保保鲜膜和胶之间没有气泡。
(5)在干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测,或用其它适当仪器设备检测。EMSA的典型分析
结果可以参见下面的图1。
图1.一个典型的EMSA/Gel-Shift分析图
1,阴性对照反应(标记探针);2,常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针);3,探针
冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针100倍量的未标记探针);4,突变
探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+标记探针100倍量的未标记突变探
针);5,Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白+标记探针+目的转录因子的特异抗
体)。 |