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细胞相关> 细胞死亡与自噬> 细胞凋亡
彗星电泳试剂盒
产品编号: C2041M
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价格: ¥ 998.00
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C2041S 彗星电泳试剂盒 20次 378.00元
C2041M 彗星电泳试剂盒 100次 998.00元

碧云天生产的彗星电泳试剂盒(Comet Assay Kit),也称彗星检测试剂盒、彗星电泳检测试剂盒、彗星电泳DNA损伤检测试剂盒(DNA Damage Comet Assay Kit),是一种简单、快速、高效的通过电泳检测单细胞DNA损伤的试剂盒。彗星电泳实验也被称为单细胞凝胶电泳检测(Single Cell Gel Electrophoresis Assay, SCGE),是一种快速检测单细胞DNA损伤的实验方法,因在电泳时观察到的DNA受损细胞形似彗星的图像,故称彗星电泳或彗星试验[1]。

常见的DNA损伤有碱基修饰、DNA链内和链间交联、DNA单链断裂(Single strand-breaks, SSBs)以及DNA双链断裂(Double-strand breaks, DSBs)等,其中DSBs被认为是最严重的DNA损伤。引起DNA产生DSBs的物理或化学因素有紫外线照射、电离辐射(X、γ射线等)、遗传毒性化学物质和化疗药物等。DSBs的无效修复或错误修复可以引发基因组紊乱,最终导致肿瘤及其它相关疾病的发生[2]。

根据DNA损伤的原理,DNA的损伤检测可以分为三类:基于损伤DNA理化性质的改变,如彗星实验;基于分子杂交,如荧光原位杂交法(Fluorescence in situ hybridization, FISH);基于DNA损伤后形成的产物检测DNA损伤,如检测磷酸化的H2AX、暴露的3'-OH (TUNEL检测)和8-OHdG等。前两种方法是基于荧光标记直接观测DNA的损伤情况,而基于DNA损伤后形成产物检测DNA损伤是通过标记物间接反映DNA的损伤程度。本彗星电泳试剂盒基于荧光标记直接检测DNA的损伤情况,最初由Östling和Johansson在1984年发明,此后由Singh等在1988年改进,此后成为评估DNA损伤与修复、遗传毒性检测常用的标准实验技术[3-6]。

彗星电泳是一种检测真核细胞DNA损伤的常用方法,其检测原理如下。低熔点琼脂糖凝胶具有在37℃下保持溶液状态的特点,可保持细胞的原有状态,不会造成额外的DNA损伤,避免了正常熔点琼脂糖需要更高温度熔解而导致的细胞损伤。因此将细胞包埋在含有低熔点琼脂糖凝胶的载玻片上,细胞经裂解后,正常细胞细胞核中的大分子DNA由于其完整性,在电场作用下迁移速率基本一致,DNA荧光染色仍然能保持细胞核的形态或有非常轻微的拖尾;如果DNA发生单链或双链断裂,在电场作用下,不同分子量的DNA呈现不同的迁移速率,大分子DNA迁移速率较低,而小分子DNA片段迁移速率较快,荧光染色后,大分子DNA仍然呈现细胞核样的形态,形似彗星的头部(Comet head),小分子DNA呈现逸出细胞核的拖尾形态,形似彗星的尾巴(Comet tail)。DNA损伤越严重,小分子DNA片段就越多并且片段越小,电泳时的迁移速率越快,彗星状拖尾就越长。因此,通过测定彗尾部分的光密度或长度就可定量测定单个细胞DNA损伤程度[6]。使用本试剂盒检测HeLa细胞中DNA损伤的效果参考图1。

图1.碧云天彗星电泳试剂盒(C2041)检测HeLa细胞中DNA损伤的效果图。正常培养条件下的HeLa细胞中(Control),几乎没有彗星状拖尾,说明DNA很完整;在25μM或50μM Camptothecin (SC0141)诱导1小时后,部分细胞核出现明显的彗尾,说明DNA出现不同程度的损伤。实际染色效果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异,图中效果仅供参考。

根据裂解液的差异,彗星电泳可以分为中性彗星电泳和碱性彗星电泳。中性彗星电泳,主要用于检测DNA双链的断裂;碱性彗星电泳,灵敏度更高,可以检测更少量的单双链断裂、DNA的碱性不稳定位点及不完整切除修复引起的DNA链的断裂等。本试剂盒采用了常用的碱性彗星电泳法。

本试剂盒小包装可以检测20个样品,中包装可以检测100个样品。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
C2041S-1 Lysis Buffer 200ml
C2041S-2 DMSO 20ml
C2041S-3 Normal Melting Point Agarose 100mg
C2041S-4 Low Melting Point Agarose 70mg
C2041S-5 Propidium Iodide Solution 400μl
说明书 1份

产品编号 产品名称 包装
C2041M-1 Lysis Buffer 500ml×2
C2041M-2 DMSO 100ml
C2041M-3 Normal Melting Point Agarose 500mg
C2041M-4 Low Melting Point Agarose 350mg
C2041M-5 Propidium Iodide Solution 2ml
说明书 1份
保存条件:

4℃保存,一年有效。其中Propidium Iodide Solution须避光保存。DMSO、Normal Melting Point Agarose、Low Melting Point Agarose也可室温保存。

注意事项:

Lysis Buffer必须完全溶解后再使用,如有沉淀,可37℃水浴充分溶解。

从细胞裂解步骤开始,所有的试剂均应提前在4℃预冷后用于细胞,并在裂解、解旋、电泳、中和过程中保持4℃低温状态及避光,防止诱发额外的DNA损伤。重点注意避免日光、日光灯等中的紫外线对DNA的损伤。

需使用不含钙、镁离子的PBS,推荐使用碧云天的PBS (C0221A)

DNA损伤的阳性对照可通过一定浓度的Camptothecin (SC0141)Cisplatin (S1552)Etoposide (SC0173)等进行诱导,具体可参考碧云天的DNA损伤检测试剂盒(γ-H2AX免疫荧光法) (C2035),也可以使用100μM过氧化氢或25μM KMnO4在4℃处理20分钟。

本试剂盒中Propidium Iodide Solution对人体有害,操作时请小心,并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.用户自备仪器、耗材和试剂。
a.仪器、耗材:水平电泳仪、荧光显微镜、微波炉、恒温水浴箱、载玻片和盖玻片。推荐使用碧云天的专门用于彗星电泳分析的载玻片(Comet Assay Slide)(FSL061)粘附载玻片(表面带正电荷) (FSL051)精装盖玻片(18×18) (FCGF18)等。
b.试剂:PBS (C0221A),中性缓冲液(0.4M Tris-HCl, pH7.5,可使用1M Tris-HCl, pH7.5 (Sterile, DNase free) (ST775)进行配制),电泳缓冲液(1mM EDTA (pH8.0),200mM NaOH,无须调整pH,最终pH约为13)。电泳缓冲液的配制如下表所示,推荐使用ST876 BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile)进行配制。注:中性缓冲液及电泳缓冲液需新鲜配制后置于4℃预冷。
Reagent Volume
NaOH 4g
0.5M EDTA (ST066) 1ml
Ultrapure Water 499ml
Total Volume 500ml
2.试剂盒的准备。
a.1%正常熔点琼脂糖凝胶配制:根据琼脂糖凝胶的浓度和体积计算出所需琼脂糖的重量,称取适量正常熔点琼脂糖(Normal Melting Point Agarose)加入合适的容器(如50ml离心管(FTUB550))中,加入适量的PBS后加热溶解。例如100mg正常熔点琼脂糖中加入10ml PBS,适当晃动混匀琼脂糖粉末,微波炉加热煮沸琼脂糖溶液或置于90-100℃水浴中至完全溶解。随后置于45℃水浴中冷却后备用。未使用完的1%正常熔点琼脂糖凝胶可在4℃保存,下次重新熔解后使用。
注:如有必要可以在液面处作一标记,以便于部分水分挥发后可以用超纯水或去离子水补充至最初的体积。
b.0.7%低熔点琼脂糖凝胶配制:根据琼脂糖凝胶的浓度和体积计算出所需低熔点琼脂糖的重量,称取适量低熔点琼脂糖(Low Melting Point Agarose)加入合适的容器(如50ml离心管(FTUB550))中,加入适量的PBS后加热溶解。例如70mg低熔点琼脂糖中加入10ml PBS,适当晃动混匀低熔点琼脂糖粉末,70-80℃水浴5-10分钟,使琼脂糖溶液完全溶解。随后置于37℃水浴中冷却至少20分钟后备用。未使用完的0.7%低熔点琼脂糖凝胶可在4℃保存,下次重新熔解后使用。
注1:低熔点琼脂糖在37℃水浴中冷却至少20分钟非常重要,否则过高的温度会引起DNA的损伤。
注2:低熔点琼脂糖最好在70-80℃水浴中溶解,不要用微波炉。
注3:低熔点琼脂糖溶液可以在37℃保持溶液状态1-2小时。
3.样品的准备。
a.贴壁细胞:收集细胞上清(含悬浮的细胞),贴壁细胞用胰酶消化,收集细胞悬液后和收集的细胞上清混合,离心去除上清。细胞用冰浴预冷的PBS洗涤一次,离心收集细胞沉淀,加入适量PBS重悬使细胞密度为1×106个/ml。
b.悬浮细胞:收集细胞悬液后离心去上清,细胞用冰浴预冷的PBS洗涤一次,离心收集细胞沉淀,加入适量的PBS重悬使细胞密度为1×106个/ml。
c.组织样品:将组织参考文献方法例如使用胰酶、胶原酶等消化处理制作成细胞悬液,然后参考悬浮细胞进行操作。
注1:细胞最好是新鲜制备的。如果使用冻存的细胞,需要先确定冻存是否会对细胞造成额外的DNA损伤。
注2:每次实验,需要设置未经处理的正常细胞作为空白对照(Control)。
4.制片。
a.第一层凝胶的制备:该层为1%正常熔点琼脂糖凝胶。将载玻片的磨砂面朝上,45℃预热,将预热的30µl 1%正常熔点琼脂糖凝胶铺在彗星电泳载玻片的圆孔内或载玻片上,盖上盖玻片,4℃放置10分钟使其凝固。轻轻移去盖玻片,室温放置备用,此时凝胶为薄薄的一层。
注1:盖上盖玻片时须避免产生气泡。
注2:移去盖玻片时先轻轻推移,使盖玻片适当移位后,再用尖头镊子慢慢掀开,避免把胶弄破。去掉盖玻片后,室温放置晾干过夜,第一层凝胶的贴壁效果更好。18×18mm的盖玻片比24×24mm的更容易移去,推荐使用18×18mm的盖玻片。
注3:对于未测试过的载玻片,建议先确定正常熔点琼脂糖凝胶在该载玻片上不脱落。也可使用适当的毛玻璃或磨砂载玻片,凝胶不容易脱落,也不影响后续荧光观察。
b.第二层凝胶的制备:该层为含有细胞悬液的低熔点琼脂糖。将10µl细胞(约104个)和75µl 37℃水浴的0.7%低熔点琼脂糖混合均匀,然后迅速吸取70µl滴加到第一层凝胶上,用移液器吸头轻轻的铺开铺匀,覆盖整个第一层胶,或盖上盖玻片,4℃放置10分钟使其凝固。
注1:铺胶时须避免有气泡产生。如样品较多,可以在放置在37℃水浴中的1.5ml离心管中分装好低熔点琼脂糖,再加入细胞混匀,混好后及时铺胶,防止胶凝固。
注2:一般情况,只需用移液器吸头轻轻的铺开铺匀,无须盖上盖玻片。盖上盖玻片,后续移去时可能会使第二层凝胶脱落。
c.第三层凝胶的制备(选做):第二层凝胶凝固后,滴加75µl 37℃预热的0.7%低熔点琼脂糖。盖上一片新盖玻片,4℃放置30分钟使其凝固。铺胶时须避免有气泡产生。
注:双层凝胶法制片,既能使凝胶有较好的附着,又能使细胞尽可能多的处于同一平面,染色效果更好;三层胶一定程度上解决了脱落漂浮的问题,但可能会影响观察的效果。
5.细胞裂解。
a.裂解液的配制:按照Lysis Buffer与DMSO的比例为9:1配制裂解液,例如取9ml Lysis Buffer加入1ml DMSO,混匀即得10ml裂解液。配制完毕后,置于4℃预冷备用。注:裂解液须现用现配。裂解液在室温可能会出现浑浊,充分混匀后或混匀后置于4℃会变澄清。
注:如果细胞或组织样品中含有红细胞或血红蛋白(hemoglobin),DMSO可避免其中的亚铁血红素(heme)中的铁催化产生的活性氧而导致的DNA损伤。如果样品中不含血红蛋白或亚铁血红素,裂解液中也可以不加入DMSO。
b.如果有盖玻片,参考步骤4a轻轻移去盖玻片,将载玻片置于10cm培养皿中,倒入约10ml预冷的裂解液,淹没凝胶和载玻片。4℃裂解1-2小时或过夜,取出载玻片用PBS漂洗3分钟。
6.DNA解旋。
将载玻片置于水平电泳槽中,倒入电泳缓冲液,至少高于载玻片胶面0.25cm左右,室温放置20-60分钟。该步骤使DNA双链在碱性条件下解螺旋,并使断裂的小片段DNA在电场中易于迁移。
7.电泳。
电泳可在任何水平电泳槽中进行,电泳电压一般为低电压25V (~0.75-1V/cm),电泳时间通常在20-30分钟的短时间内进行。
注1:电泳时宜低温最好是冰浴,并避光。推荐在冷库或4℃冰箱中避光电泳。不同电泳槽的电泳时间需要适当调整,保持电场强度约0.75-1V/cm即可。
注2:电压过高或电泳时间过长,非受损细胞的DNA也可能会出现彗星形态的假阳性结果;反之,电压过低或时间过短,小片段DNA电泳不充分,受损细胞无彗星拖尾而造成假阴性结果。
8.中和与染色。
电泳后将载玻片置于平皿内,加入中性缓冲液,将载玻片没入即可,4℃中和1-3次,每次5-10分钟,弃去中性缓冲液,在载玻片上滴加约20µl Propidium Iodide Solution,避光染色10-20分钟。然后超纯水(Ultrapure Water)洗涤3次,盖上盖玻片,随后即可在荧光显微镜下观察。
注1:凝胶在细胞裂解、DNA解旋、电泳和中和之后与载玻片的结合可能不如之前紧密,因此在电泳和中和后要轻取轻放,宜水平轻轻取出,以免凝胶脱落。
注2:如果使用透明载玻片,一般中和1次,5分钟即可,中和次数越多,凝胶越容易脱落。中性缓冲液浸没载玻片即可,太多会使凝胶脱落。
注3:也可以使用EB、DAPI、SYBR Gold、SYBR Green、NA-Red、Gel-Red、NA-Green、Gel-Green等荧光染料或银染的方式进行染色,并用相应的检测方法进行检测。
9.观察、拍照和实验结果分析。
a.观察和拍照:在荧光显微镜下观察,Propidium Iodide为红色荧光,Ex/Em=535/617nm。
b.结果分析:碱性彗星电泳测定DNA损伤常见的性状指标有彗星细胞率,距离指标有彗星总长、尾长、彗星头部半径、彗星尾部半径等,强度指标有头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等,矩类指标包括尾矩等。尾长(Length of Tail),即未损伤的大分子DNA和损伤的小分子DNA迁移的长度差(图2中的Tail),在低损伤剂量范围内与DNA损伤呈线性关系;尾部DNA百分比(Percentage of DNA in the Tail, Tail DNA %),是尾部占总细胞DNA的百分比;尾矩(Tail Moment),即尾长与尾部DNA百分含量之乘积,在高损伤剂量下与损伤程度呈线性关系,是结合了尾部DNA的量与相对于细胞核的迁移距离。最重要的两个指标是尾部DNA百分含量和尾矩,具体计算方式如下:
Tail DNA (%) = 100 × Tail DNA Intensity / Cell DNA Intensity
Tail Moment有两种计算方式:
(a)Olive Tail Moment=Tail DNA (%) × Tail Moment Length*
(b)Extent Tail Moment=Tail DNA (%) × Length of Tail
*Tail Moment Length is measured from the center of the head to the center of the tail (参见图2)。
图2.彗星电泳中细胞DNA损伤的尾矩。 c.DNA损伤判定:每个样品随机选择50-100个细胞,测定相应指标。DNA损伤按尾部DNA百分比的比例分为5级,可使用:
0级:<5% 无损伤;
1级:5~20% 轻度损伤;
2级:20~40% 中度损伤;
3级:40~95% 高度损伤;
4级:>95% 重度损伤。
参考文献:
1.Malyapa RS, Bi C, Ahern EW, Roti Roti JL. Radiat Res. 1998. 149(4):396-400.
2.Parshad R, Sanford KK. Crit Rev Oncol Hematol. 2001. 37(2):87-96.
3.Gabriela Figueroa-González, Carlos Pérez-Plasencia. Oncol Lett. 2017. Jun; 13(6): 3982-3988.
4.Marc D. Roy. Biotechniques. 2018. VOL. 42, NO. 4.
5.D.V.Firsanov, L.V.Solovjeva, V.M.Mikhailov, M.P.Svetlova. Genome Stability. 2016. pp. 635-649.
6.Singh NP, McCoy MT, Tice RR, Schneider EL. Exp Cell Res. 1988. 175(1):184-91.
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