使用说明：
1.用户自备仪器、耗材和试剂。
a.仪器、耗材：水平电泳仪、荧光显微镜、微波炉、恒温水浴箱、载玻片和盖玻片。推荐使用碧云天的专门用于彗星电泳分析的载玻片(Comet Assay Slide)(FSL061)或粘附载玻片(表面带正电荷) (FSL051)和精装盖玻片(18×18) (FCGF18)等。
b.试剂：PBS (C0221A)，中性缓冲液(0.4M Tris-HCl, pH7.5，可使用1M Tris-HCl, pH7.5 (Sterile, DNase free) (ST775)进行配制)，电泳缓冲液(1mM EDTA (pH8.0)，200mM NaOH，无须调整pH，最终pH约为13)。电泳缓冲液的配制如下表所示，推荐使用ST876 BeyoPure™ Ultrapure Water (DNase/RNase-Free, Sterile)进行配制。注：中性缓冲液及电泳缓冲液需新鲜配制后置于4℃预冷。

Reagent	Volume
NaOH	4g
0.5M EDTA (ST066)	1ml
Ultrapure Water	499ml
Total Volume	500ml

2.试剂盒的准备。
a.1%正常熔点琼脂糖凝胶配制：根据琼脂糖凝胶的浓度和体积计算出所需琼脂糖的重量，称取适量正常熔点琼脂糖(Normal Melting Point Agarose)加入合适的容器(如50ml离心管(FTUB550))中，加入适量的PBS后加热溶解。例如100mg正常熔点琼脂糖中加入10ml PBS，适当晃动混匀琼脂糖粉末，微波炉加热煮沸琼脂糖溶液或置于90-100℃水浴中至完全溶解。随后置于45℃水浴中冷却后备用。未使用完的1%正常熔点琼脂糖凝胶可在4℃保存，下次重新熔解后使用。
注：如有必要可以在液面处作一标记，以便于部分水分挥发后可以用超纯水或去离子水补充至最初的体积。
b.0.7%低熔点琼脂糖凝胶配制：根据琼脂糖凝胶的浓度和体积计算出所需低熔点琼脂糖的重量，称取适量低熔点琼脂糖(Low Melting Point Agarose)加入合适的容器(如50ml离心管(FTUB550))中，加入适量的PBS后加热溶解。例如70mg低熔点琼脂糖中加入10ml PBS，适当晃动混匀低熔点琼脂糖粉末，70-80℃水浴5-10分钟，使琼脂糖溶液完全溶解。随后置于37℃水浴中冷却至少20分钟后备用。未使用完的0.7%低熔点琼脂糖凝胶可在4℃保存，下次重新熔解后使用。
注1：低熔点琼脂糖在37℃水浴中冷却至少20分钟非常重要，否则过高的温度会引起DNA的损伤。
注2：低熔点琼脂糖最好在70-80℃水浴中溶解，不要用微波炉。
注3：低熔点琼脂糖溶液可以在37℃保持溶液状态1-2小时。
3.样品的准备。
a.贴壁细胞：收集细胞上清(含悬浮的细胞)，贴壁细胞用胰酶消化，收集细胞悬液后和收集的细胞上清混合，离心去除上清。细胞用冰浴预冷的PBS洗涤一次，离心收集细胞沉淀，加入适量PBS重悬使细胞密度为1×10⁶个/ml。
b.悬浮细胞：收集细胞悬液后离心去上清，细胞用冰浴预冷的PBS洗涤一次，离心收集细胞沉淀，加入适量的PBS重悬使细胞密度为1×10⁶个/ml。
c.组织样品：将组织参考文献方法例如使用胰酶、胶原酶等消化处理制作成细胞悬液，然后参考悬浮细胞进行操作。
注1：细胞最好是新鲜制备的。如果使用冻存的细胞，需要先确定冻存是否会对细胞造成额外的DNA损伤。
注2：每次实验，需要设置未经处理的正常细胞作为空白对照(Control)。
4.制片。
a.第一层凝胶的制备：该层为1%正常熔点琼脂糖凝胶。将载玻片的磨砂面朝上，45℃预热，将预热的30µl 1%正常熔点琼脂糖凝胶铺在彗星电泳载玻片的圆孔内或载玻片上，盖上盖玻片，4℃放置10分钟使其凝固。轻轻移去盖玻片，室温放置备用，此时凝胶为薄薄的一层。
注1：盖上盖玻片时须避免产生气泡。
注2：移去盖玻片时先轻轻推移，使盖玻片适当移位后，再用尖头镊子慢慢掀开，避免把胶弄破。去掉盖玻片后，室温放置晾干过夜，第一层凝胶的贴壁效果更好。18×18mm的盖玻片比24×24mm的更容易移去，推荐使用18×18mm的盖玻片。
注3：对于未测试过的载玻片，建议先确定正常熔点琼脂糖凝胶在该载玻片上不脱落。也可使用适当的毛玻璃或磨砂载玻片，凝胶不容易脱落，也不影响后续荧光观察。
b.第二层凝胶的制备：该层为含有细胞悬液的低熔点琼脂糖。将10µl细胞(约10⁴个)和75µl 37℃水浴的0.7%低熔点琼脂糖混合均匀，然后迅速吸取70µl滴加到第一层凝胶上，用移液器吸头轻轻的铺开铺匀，覆盖整个第一层胶，或盖上盖玻片，4℃放置10分钟使其凝固。
注1：铺胶时须避免有气泡产生。如样品较多，可以在放置在37℃水浴中的1.5ml离心管中分装好低熔点琼脂糖，再加入细胞混匀，混好后及时铺胶，防止胶凝固。
注2：一般情况，只需用移液器吸头轻轻的铺开铺匀，无须盖上盖玻片。盖上盖玻片，后续移去时可能会使第二层凝胶脱落。
c.第三层凝胶的制备(选做)：第二层凝胶凝固后，滴加75µl 37℃预热的0.7%低熔点琼脂糖。盖上一片新盖玻片，4℃放置30分钟使其凝固。铺胶时须避免有气泡产生。
注：双层凝胶法制片，既能使凝胶有较好的附着，又能使细胞尽可能多的处于同一平面，染色效果更好；三层胶一定程度上解决了脱落漂浮的问题，但可能会影响观察的效果。
5.细胞裂解。
a.裂解液的配制：按照Lysis Buffer与DMSO的比例为9:1配制裂解液，例如取9ml Lysis Buffer加入1ml DMSO，混匀即得10ml裂解液。配制完毕后，置于4℃预冷备用。注：裂解液须现用现配。裂解液在室温可能会出现浑浊，充分混匀后或混匀后置于4℃会变澄清。
注：如果细胞或组织样品中含有红细胞或血红蛋白(hemoglobin)，DMSO可避免其中的亚铁血红素(heme)中的铁催化产生的活性氧而导致的DNA损伤。如果样品中不含血红蛋白或亚铁血红素，裂解液中也可以不加入DMSO。
b.如果有盖玻片，参考步骤4a轻轻移去盖玻片，将载玻片置于10cm培养皿中，倒入约10ml预冷的裂解液，淹没凝胶和载玻片。4℃裂解1-2小时或过夜，取出载玻片用PBS漂洗3分钟。
6.DNA解旋。
将载玻片置于水平电泳槽中，倒入电泳缓冲液，至少高于载玻片胶面0.25cm左右，室温放置20-60分钟。该步骤使DNA双链在碱性条件下解螺旋，并使断裂的小片段DNA在电场中易于迁移。
7.电泳。
电泳可在任何水平电泳槽中进行，电泳电压一般为低电压25V (~0.75-1V/cm)，电泳时间通常在20-30分钟的短时间内进行。
注1：电泳时宜低温最好是冰浴，并避光。推荐在冷库或4℃冰箱中避光电泳。不同电泳槽的电泳时间需要适当调整，保持电场强度约0.75-1V/cm即可。
注2：电压过高或电泳时间过长，非受损细胞的DNA也可能会出现彗星形态的假阳性结果；反之，电压过低或时间过短，小片段DNA电泳不充分，受损细胞无彗星拖尾而造成假阴性结果。
8.中和与染色。
电泳后将载玻片置于平皿内，加入中性缓冲液，将载玻片没入即可，4℃中和1-3次，每次5-10分钟，弃去中性缓冲液，在载玻片上滴加约20µl Propidium Iodide Solution，避光染色10-20分钟。然后超纯水(Ultrapure Water)洗涤3次，盖上盖玻片，随后即可在荧光显微镜下观察。
注1：凝胶在细胞裂解、DNA解旋、电泳和中和之后与载玻片的结合可能不如之前紧密，因此在电泳和中和后要轻取轻放，宜水平轻轻取出，以免凝胶脱落。
注2：如果使用透明载玻片，一般中和1次，5分钟即可，中和次数越多，凝胶越容易脱落。中性缓冲液浸没载玻片即可，太多会使凝胶脱落。
注3：也可以使用EB、DAPI、SYBR Gold、SYBR Green、NA-Red、Gel-Red、NA-Green、Gel-Green等荧光染料或银染的方式进行染色，并用相应的检测方法进行检测。
9.观察、拍照和实验结果分析。
a.观察和拍照：在荧光显微镜下观察，Propidium Iodide为红色荧光，Ex/Em=535/617nm。
b.结果分析：碱性彗星电泳测定DNA损伤常见的性状指标有彗星细胞率，距离指标有彗星总长、尾长、彗星头部半径、彗星尾部半径等，强度指标有头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等，矩类指标包括尾矩等。尾长(Length of Tail)，即未损伤的大分子DNA和损伤的小分子DNA迁移的长度差(图2中的Tail)，在低损伤剂量范围内与DNA损伤呈线性关系；尾部DNA百分比(Percentage of DNA in the Tail, Tail DNA %)，是尾部占总细胞DNA的百分比；尾矩(Tail Moment)，即尾长与尾部DNA百分含量之乘积，在高损伤剂量下与损伤程度呈线性关系，是结合了尾部DNA的量与相对于细胞核的迁移距离。最重要的两个指标是尾部DNA百分含量和尾矩，具体计算方式如下：
Tail DNA (%) = 100 × Tail DNA Intensity / Cell DNA Intensity
Tail Moment有两种计算方式：
(a)Olive Tail Moment=Tail DNA (%) × Tail Moment Length*
(b)Extent Tail Moment=Tail DNA (%) × Length of Tail
*Tail Moment Length is measured from the center of the head to the center of the tail (参见图2)。
图2.彗星电泳中细胞DNA损伤的尾矩。 c.DNA损伤判定：每个样品随机选择50-100个细胞，测定相应指标。DNA损伤按尾部DNA百分比的比例分为5级，可使用：
0级：<5% 无损伤；
1级：5~20% 轻度损伤；
2级：20~40% 中度损伤；
3级：40~95% 高度损伤；
4级：>95% 重度损伤。
参考文献：
1.Malyapa RS, Bi C, Ahern EW, Roti Roti JL. Radiat Res. 1998. 149(4):396-400.
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4.Marc D. Roy. Biotechniques. 2018. VOL. 42, NO. 4.
5.D.V.Firsanov, L.V.Solovjeva, V.M.Mikhailov, M.P.Svetlova. Genome Stability. 2016. pp. 635-649.
6.Singh NP, McCoy MT, Tice RR, Schneider EL. Exp Cell Res. 1988. 175(1):184-91.
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