使用说明：
1.感染条件的确定：
MOI (Multiplicity of Infection)定义：病毒感染细胞时，病毒数量与细胞数量的比值。TU (Transduction Units)定义：具有生物活性的病毒颗粒数量。梯度稀释病毒后感染细胞，根据出现荧光的细胞数量或抽提细胞基因组DNA进行qPCR测定来确定具有生物活性的病毒颗粒数量。不同种类的细胞感染所需的MOI值是不同的，如果是初次使用慢病毒感染需要通过实验确定最佳的感染条件。理论上MOI值越高，慢病毒感染可能性越大，感染效率越高，对细胞的毒性也越大。所以预实验的目的是在保证细胞成活率的情况下，确定能够使感染效率达到适宜观察水平的MOI值。
a.细胞培养(以24孔板HEK293T细胞为例，其它培养板或培养皿参考24孔板进行操作)：感染前一天，在24孔板中以约5×10⁴/孔接种HEK293T细胞，每孔加入0.5ml完全培养液，使第二天病毒感染时的细胞密度达到约70-80% (细胞数约1×10⁵)。注：具体接种数量需根据细胞种类、细胞大小和细胞生长速度等因素而确定。
b.设置MOI值分别为1、2、5、10、20，计算所需病毒量，计算公式如下：
TU = 感染时的细胞数* × MOI
病毒母液(μl) = TU / 滴度(TU/ml) × 1000
*一般第二天细胞数按接种细胞数增长1倍来计算，增殖较慢或不增殖的细胞可适当调整。
例如：需要向1×10⁵个HEK293T细胞加入20 MOI的病毒，即所需TU = (1×10⁵ cells) × (20 MOI) = 2×10⁶ TU。若病毒母液滴度为1×10⁹ TU/ml，则细胞培养液中应加入病毒母液 = 2×10⁶ TU / (1×10⁹ TU/ml) × 1000 = 2μl，即2μl病毒母液。
注：其它细胞株的预实验MOI设置可以参考本说明书中产品简介部分“碧云天推荐的慢病毒感染不同种类体外培养细胞的MOI值”表格或相关文献资料。
c.按照下图设置MOI预实验组，建议设置复孔以确保实验准确性。注：对于适合使用聚凝胺(polybrene) (C0351/ST1380)处理的细胞，弃旧培养液，每孔加入250μl含有6-8μg/ml polybrene的新鲜培养液；对于不适合使用polybrene处理的细胞，弃旧培养液，每孔加入250μl的新鲜培养液。使用polybrene可以使感染效率提高约2-10倍，并且病毒测定其活力的时候是使用polybrene的。须特别注意此时宜加入尽量少的新鲜培养液，以提升后续病毒的感染效率。
图4.细胞感染MOI值预实验设计分组。MOI依次设置为：1、2、5、10、20。并同时设置加含6-8μg/ml polybrene的培养液实验组，不含polybrene的培养液实验组及Blank组(空白对照组)。Blank组可作为参照，以检验细胞生长状态。本图中实验设置仅供参考，用户应根据实际情况自行适当调整。
d.取出本产品置于冰上解冻，混匀后，将根据特定MOI值计算好的病毒母液量分别加入细胞培养板中，轻轻混匀后继续培养。注：如果病毒滴度太高，需加的病毒母液量较少或多孔板如96孔板和48孔板等培养液体积比较小的情况，可以先将病毒母液用培养液进行适当稀释后再加入。
e.感染后约4小时，每孔补加250μl新鲜培养液。
f.感染后约24小时，进行换液。弃含病毒的培养液，每孔加入新鲜的完全培养液，继续培养。注：换液的具体时间需视细胞状态而定，如果慢病毒对细胞有明显毒性作用，影响细胞生长状态，最短可于加病毒4小时后更换新鲜培养液。
g.继续培养约48-96小时后观察细胞生长状况及荧光蛋白表达情况，以不显著影响细胞生长、荧光较强且感染效率便于荧光观察的MOI值和感染后时间为最佳条件。
h.如果有必要，可以根据特定细胞加入适当浓度的嘌呤霉素(Puromycin) (ST551)，以筛选被感染的细胞，后续可以通过稀释法等获取单克隆细胞株。嘌呤霉素的浓度可以通过梯度稀释的预实验来确定，以刚好能完全杀死目的细胞的浓度为宜。
注1：细胞并非感染效率越高越好，通常约20-70%的感染效率已经足以进行后续检测，感染效率过高反而容易产生细胞毒性而干扰检测。
注2：通常在慢病毒感染细胞后72小时即可观察到荧光蛋白表达的出现，在96小时左右有较强的表达效果。
注3：对于感染慢病毒后出现较强细胞毒性的情况，可以尝试在感染后4小时更换成新鲜的完全培养液。
2.感染细胞和荧光观察：
按照步骤1获得的条件进行病毒感染实验，在观察到CD81-EGFP的红色荧光后，或者在筛选获得CD81-EGFP的稳定表达细胞株后，进行后续实验。
附录：
1.慢病毒使用安全规范：
a.作为一种相对安全的病毒，尽管慢病毒在正常细胞内不能进行复制和扩增，但是慢病毒基因组可以整合到被感染细胞的基因组中，因此仍然具有可能的潜在生物学危险。我们建议使用者在病毒操作前应仔细阅读本规范，并在实验中严格按照本规范的要求进行操作。更为严格的美国CDC的生物安全等级及其操作与防护要求参考附表1，也可以访问如下网页：https://www.cdc.gov/labs/pdf/CDC-BiosafetyMicrobiologicalBiomedicalLaboratories-2020-P.pdf。
b.慢病毒操作时应使用相应级别的生物安全柜，不同的慢病毒的生物安全等级会有所不同。如果使用普通超净工作台操作病毒，请不要打开排风机，以尽量避免可能污染病毒的尘埃正面吹向操作人员而被吸入。
c.实验操作时必需佩戴一次性帽子、口罩，穿戴实验手套及专门的实验服，避免身体直接接触病毒。手部及面部有开放性创口时，禁止进行病毒操作。
d.操作病毒时需小心谨慎，不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台或其它器皿上有病毒污染，请立即用70%乙醇或2% SDS溶液擦拭干净，或者采取其它的妥善措施。
e.如果需要离心，应使用密封性好的离心管，或用封口膜密封后离心，最好使用专门的离心机。
f.用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板，用70%乙醇清理培养瓶或培养板外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验台之前，用70%乙醇擦洗显微镜实验台。
g.所有被病毒污染过的枪头、离心管、培养板(皿、瓶)、培养液、手套等，在丢弃前请用84消毒液或2% SDS浸泡过夜。
h.脱掉手套后，用肥皂或洗手液清洗双手。
i.病毒飞溅或是含有病毒的气溶胶与人体接触，须用大量清水冲洗眼睛、皮肤或粘膜等接触的部位至少15min。
j.含病毒的针头或是其它利器刺破皮肤，伤口应立即用10%的碘伏溶液擦洗数分钟，然后用大量清水冲洗。
k.装盛慢病毒的实验用品需单独放置，并须加以适当标示。
l.对同实验室的人员须进行慢病毒安全培训或安全警示。
2.生物安全等级及其操作与防护要求：
Summary of Recommended Biosafety Levels for Infectious Agents

BSL	Agents	Practices	Primary Barriers andSafety Equipment	Facilities(Secondary Barriers)
1	Not known to consistently cause diseases in healthy adults	Standard microbiological practices	■ No primary barriers required. ■ PPE: laboratory coats and gloves; eye, face protection, as needed	Laboratory bench and sink required
2	■ Agents associated with human disease ■ Routes of transmission include percutaneous injury, ingestion, mucous membrane exposure	BSL-1 practice plus: ■ Limited access ■ Biohazard warning signs ■ “Sharps” precautions ■ Biosafety manual defining any needed waste decontamination or medical surveillance policies	Primary barriers: ■ BSCs or other physical containment devices used for all manipulations of agents that cause splashes or aerosols of infectious materials ■ PPE: Laboratory coats, gloves, face and eye protection, as needed	BSL-1 plus: ■ Autoclave available
3	Indigenous or exotic agents that may cause serious or potentially lethal disease through the inhalation route of exposure	BSL-2 practice plus: ■ Controlled access ■ Decontamination of all waste ■ Decontamination of laboratory clothing before laundering	Primary barriers: ■ BSCs or other physical containment devices used for all open manipulations of agents ■ PPE: Protective laboratory clothing, gloves, face, eye and respiratory protection, as needed	BSL-2 plus: ■ Physical separation from access corridors ■ Self-closing, double-door access ■ Exhausted air not recirculated ■ Negative airflow into laboratory ■ Entry through airlock or anteroom ■ Hand washing sink near laboratory exit
4	■ Dangerous/exotic agents which post high individual risk of aerosol-transmitted laboratory infections that are frequently fatal, for which there are no vaccines or treatments ■ Agents with a close or identical antigenic relationship to an agent requiring BSL-4 until data are available to redesignate the level ■ Related agents with unknown risk of transmission	BSL-3 practices plus: ■ Clothing change before entering ■ Shower on exit ■ All material decontaminated on exit from facility	Primary barriers: ■ All procedures conducted in Class III BSCs or Class I or II BSCs in combination with full-body, air-supplied, positive pressure suit	BSL-3 plus: ■ Separate building or isolated zone ■ Dedicated supply and exhaust, vacuum, and decontamination systems ■ Other requirements outlined in the text

BSL, biosafety level; PPE, personal protective equipment.
参考文献：
1.Metzelaar MJ, Wijngaard PL, Peters PJ, Sixma JJ, Nieuwenhuis HK, Clevers HC. J Biol Chem. 1991. 15;266(5):3239-45.
2.Luo W, Dai Y, Chen Z, Yue X, Andrade-Powell KC, Chang J. Commun Biol. 2020. 10;3(1):114.
3.Kalluri R, LeBleu VS. Science. 2020. 367(6478).
4.He C, Zheng S, Luo Y, Wang B. Theranostics. 2018. 1;8(1):237-255.
5.Zhang Y, Bi J, Huang J, Tang Y, Du S, Li P. Int J Nanomedicine. 2020. 22;15:6917-6934.
6.Fénéant L, Levy S, Cocquerel L. Viruses. 2014. 6(2):535-72.
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