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核酸相关> 反转录与PCR> 反转录
BeyoRT™ III cDNA第一链合成试剂盒
产品编号: D7178S
产品包装:20次
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价格:¥85.00元
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产品编号 产品名称 产品包装 产品价格
D7178S BeyoRT™ III cDNA第一链合成试剂盒 20次 85.00元
D7178M BeyoRT™ III cDNA第一链合成试剂盒 100次 317.00元
D7178L BeyoRT™ III cDNA第一链合成试剂盒 500次 1295.00元

碧云天生产的BeyoRT™ III cDNA第一链合成试剂盒,即BeyoRT™ III First Strand cDNA Synthesis Kit,是一种采用了经过改造和优化的快速高效(短至10min完成反转录)、热稳定(高达55℃)、高精确度、产物超长(长达12kb)的BeyoRT™ III M-MLV反转录酶,可以用于以总RNA、mRNA等为模板反转录合成cDNA第一链的试剂盒。本试剂盒包含了进行cDNA第一链合成所需的各种试剂。
使用本试剂盒合成的第一链,可以直接用于后续的常规PCR、real-time PCR也称定量PCR(quantitative PCR, qPCR)、cDNA的第二链合成以及cDNA文库的构建, 尤其是逆转录所得目的基因的克隆等。
使用本试剂盒可以轻松完成长度为8 kb以下基因的反转录(参考图1),反转录的最大长度可以达到12 kb。

图1. 使用本试剂盒对总RNA反转录后,对于不同长度的cDNA进行PCR扩增后的电泳效果图。图中可见对于0.2-12kb的cDNA可以非常高效地被反转录。

本试剂盒中的BeyoRT™ III M-MLV反转录酶热稳定性好,反转录的效率高。本产品最适反应温度为42℃,当温度达到50℃时仍具有很高活性,对于长度较短的cDNA反转录,温度达到55℃时也可获得较高产量的cDNA。高温反转录对于高GC含量RNA的反转录,能有效减少二级结构,提高反转录效率。反转录的速度快,反转录的速度快,6kb以下的cDNA反转录只需0.5h即可完成,3kb以下的cDNA反转录10min即可完成(参考图2)。

图2. BeyoRT™ III M-MLV反转录酶在不同温度反应不同时间的反转录效果。从HEK293T细胞抽提获得的总RNA 2µg,在20μl反转录体系中按照图中所示温度、时间进行反转录。反转录后取1μl反转录产物进行目的基因(2.6kb的YWHAZ基因和6.0kb的ADAR1基因)的PCR扩增和电泳。

本试剂盒提供了RNase Inhibitor,确保在反转录过程中的RNA不会被RNA酶所降解并取得良好的反转录效果。
本试剂盒还提供了Oligo(dT)18和random hexamer这两种引物,前者适合用于带有Poly(A)尾的mRNA的反转录,后者适合用于任何RNA的反转录。也可以自行采用基因特异性引物进行cDNA第一链的合成。
失活或抑制:80℃孵育10min可以导致本产品中的BeyoRT™ III M-MLV反转录酶失活;EDTA、EGTA等螯合剂、无机磷酸盐或焦磷酸盐以及聚氨(polyamine)对BeyoRT™ III M-MLV反转录酶有抑制作用。
用于体积为20微升的cDNA第一链合成反应时,不同包装的本试剂盒足够分别进行20个、100个和500个cDNA第一链样品的合成。
包装清单:

产品编号 产品名称 包装
D7178S-1 BeyoRT™ III M-MLV反转录酶 20μl
D7178S-2 Reaction Buffer (5X) 0.1ml
D7178S-3 RNase Inhibitor (20U/μl) 20μl
D7178S-4 dNTP Mix (10 mM each) 40μl
D7178S-5 Oligo(dT)18 Primer (0.5μg/μl) 20μl
D7178S-6 Random Hexamer Primer (0.2μg/μl) 20μl
D7178S-7 DEPC-treated Water 0.3ml
说明书 1份

保存条件:
-20℃保存。
注意事项:
对于GC含量比较高的RNA的反转录,产品的使用说明中给予了特别说明,请予以关注。
本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 

使用说明:
1. cDNA第一条链的合成(First-stand cDNA Synthesis):
a. 参考如下表格设置反转录反应(RNase Inhibitor (R0102)和dNTP mix (D7373)可从碧云天订购):

模板(右侧3种任选其中一种) Total RNA 0.1ng-5μg
或poly(A) RNA/mRNA 10pg-0.5μg
或specific RNA 0.01pg-0.5μg
引物(右侧3种任选其中一种) Oligo(dT)18 primer 1μl
或 Random Hexamer primer 1μl
或 gene-specific primer 15-25pmol
DEPC-treated Water To 12μl*
选择性步骤:如果模板RNA的GC含量较高(例如大于55%)或者有比较严重的二级结构,混匀后微离心以把液体沉降至管底,65℃孵育5min,随后立即置于冰上冷却,
以打开RNA中一些比较稳定的二级结构。
Reaction Buffer (5X) 4μl
RNase Inhibitor (20U/μl) 1μl
dNTP Mix (10mM each) 2μl
BeyoRT™ III M-MLV反转录酶 1μl
总体积 20μl

*To 12μl表示加入DEPC-treated Water至最终体积为12μl。
b. 轻轻混匀(用移液器轻轻吹打混匀或用涡旋混合器在最低速度轻轻混匀),随后离心沉淀液体。
c. 如果使用Oligo(dT)18或基因特异性引物,42℃孵育10-60 min。如果使用random hexamer(随机六聚体)作为引物,先在25℃孵育10 min,随后在42℃孵育10-60 min。反转录3kb以下的cDNA,反转录10min即可,反转录3-6kb的cDNA,反转录30min即可,而6kb以上的cDNA推荐反转录60min。当使用random hexamer(随机六聚体)作为引物,并且后续用于qPCR时,检测任何长度的基因,均反转录10min就足够了。注意:对于GC含量较高或二级结构比较严重的模板RNA,可以50℃反转录60min,以充分利用本产品中的反转录酶在50℃时仍有良好活性这一特点,在较高温度进行反转录可以有效减少二级结构的干扰。
d. 80℃孵育10 min以失活BeyoRT™ III M-MLV反转录酶并终止反转录反应。说明:对于5kb以上的长片断cDNA不推荐采用加热的方法失活反转录酶,该方法易导致部分长片断DNA被剪切,此时可考虑酚氯仿抽提或柱纯化方法。
e. 反转录产物可以直接用于后续的PCR反应等,也可以-20℃冻存以备以后使用。用于后续PCR反应时,如果PCR的反应体系为20和50微升,则推荐相应地使用0.8和2微升反转录产物。
2. 引物延伸、探针标记等其它用途请自行参考M-MLV反转录酶的相关文献资料进行。

常见问题:
1. 总RNA反转录产物电泳观察不到。
反转录产物由于是从模板反转录而获得,而模板的量本身比较低,反转录的量通常还要少于模板量,并且总RNA的反转录产物大小很不均匀,因此通常总RNA的反转录产物直接电泳观察是观察不到的。
2. 反转录产物通过PCR扩增没有特异性条带。
a. PCR扩增没有获得特异性条带时建议先使用actin、GAPDH等作为内参进行PCR扩增,看是否可以成功扩增。如果可以成功,则说明PCR扩增体系没有问题,此时通常是目的基因的引物设计欠佳,当然也有可能是反转录产物质量欠佳。如果内参不能被很好地扩增,则有可能PCR体系存在问题或反转录产物质量欠佳。
b. 模板RNA发生了降解。哺乳动物细胞或组织的总RNA琼脂糖电泳后应该可以看到清晰的18S和28S rRNA条带,并且28S rRNA和18S rRNA的亮度比例应该大于等于2.0。如果比例小于2.0,则提示总RNA发生了显著的降解,最好能重新制备总RNA样品。避免RNA降解的主要方法是,严格进行RNA的相关操作,包括带洁净手套、戴一次性口罩、在洁净环境中抽提或制备RNA,以尽量避免RNase污染。
c. 模板RNA的纯度偏低。在提取纯化RNA的过程中,残留在溶液中的一些成分如苯酚、SDS、EDTA、胍盐、磷酸、焦磷酸、多胺、亚精胺等会抑制反转录酶活性。对RNA样品进行柱纯化,或者进行沉淀、洗涤和再溶解,通常可以有效去除残留的污染物。通常选择使用碧云天的BeyoZol或Trizol抽提获得的总RNA完全可以满足反转录反应的需要。
d. 反转录反应的模板量不足。在抽提获得总RNA后,在进行一些精细的定量检测时通常会进行DNase I消化,以充分去除可能的残留的DNA的干扰。DNase I进行热失活时,需要加入EDTA至终浓度为2.5mM,否则RNA在没有螯合剂的情况下,在加热过程中容易被水解,从而导致模板量不足。此外,扩增特定基因时,需要先查询该基因的组织分布特点,利用其高表达的组织进行目的基因的反转录和克隆。用该基因丰度极低的组织或细胞样品进行反转录和PCR扩增,通常会由于模板量过少而PCR扩增失败。
e. 没有使用适当的反转录引物。对于细菌RNA和不含poly(A)尾巴的RNA,要用random hexamer引物代替Oligo(dT)18引物。使用基因特异性反转录引物时,需要确保基因特异性引物设计合理正确。
如果RNA模板富含GC或容易形成二级结构,此时可以考虑把反转录温度提高到45-55℃。

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