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核酸相关> RNA相关> 切割、合成、连接和修饰
T4 RNA Ligase 2 (dsRNA Ligase)
产品编号: R0632S
产品包装:1000U
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价格: ¥ 309.00
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R0632S T4 RNA Ligase 2 (dsRNA Ligase) 1000U 309.00元

碧云天生产的T4 RNA Ligase 2,即T4 RNA连接酶2,是一种ATP依赖的双链RNA连接酶(double-strand RNA ligase, dsRNA Ligase),也被称为T4 Rnl2 (gp24.1),可以用于双链RNA进行分子内的环化连接和分子间的线性连接。T4 RNA Ligase 2与T4 RNA Ligase 1 (R0621)不同的是,对双链RNA中的缺刻(nick)的连接活性要大大高于对单链RNA末端的连接活性。T4 RNA Ligase 2也可用于双链核酸(RNA双链、RNA/DNA杂合链和/或DNA双链)分子内或分子间RNA链的3'羟基和DNA链的5'磷酸基的连接。T4 RNA Ligase 2连接时需要5'磷酸和3'羟基的存在,可以是RNA链或DNA链的5'磷酸基和RNA链的3'羟基之间发生连接反应。

T4 RNA Ligase 2催化dsRNA粘端连接的反应过程如下。首先T4 RNA Ligase 2直接消耗ATP,形成中间产物T4 RNA Ligase 2-AMP,并释放焦磷酸;接着,T4 RNA Ligase 2-AMP与dsRNA的缺刻处相结合,并将AMP从中间产物T4 RNA Ligase 2-AMP中转移至dsRNA缺刻处的5'磷酸末端,形成腺苷酰化缺刻dsRNA中间产物;最后,在T4 RNA Ligase 2的催化下,dsRNA缺刻处的3'羟基进攻该缺刻处的5'磷酸基团,形成3'-5'磷酸二酯键,并释放出AMP。

本产品酶活性高,连接效率高于国外同类竞争产品。本产品催化双链RNA粘端连接的效果请参考图1。

图1. 碧云天生产的T4 RNA Ligase 2和N公司的同类产品(Competitor T4 RNA Ligase 2)催化连接dsRNA粘端连接的效果图。 RNA-1:5'-OH-GGGCUUUGCGUGGGUUU-OH-3';RNA-2 (5'端磷酸化):5'- pCUAUAGAAACCCACGCAAAGCCC-OH-3',使用碧云天的R0051 Annealing Buffer for RNA oligos (5X),参考说明书进行退火反应。退火获得的dsRNA,在20µl反应体系中加入图中指定量的本产品或国外N公司的T4 RNA Ligase 2 (T4 Rnl2),37°C孵育30min进行连接反应,反应完毕后立即取样用15%非变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分析。如图所示,本产品与N公司的产品相比,实际的连接效率约为N公司产品的2倍,在本反应体系中碧云天生产的T4 RNA Ligase 2仅需2U就可以非常充分地完成连接反应。

用途:主要用于连接双链RNA中缺刻的连接(即双链RNA的粘端连接),也可用于双链结构中,RNA 3'羟基与DNA 5'磷酸基的缺刻连接。

来源:大肠杆菌表达的重组蛋白,表达基因为T4嗜菌体T4 RNA ligase 2。

活性单位定义::One unit is defined as the amount of enzyme required to ligate 0.4 µg of an equimolar mix of a 23-mer and 17-mer RNAs in a total reaction volume of 20 µl in 30 minutes at 37℃.

活性检测条件:50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 400 µM ATP, 37℃孵育30min。

纯度:不含DNA内切酶和外切酶,不含RNA酶,不含磷酸酯酶。

酶储存溶液:10 mM Tris-HCl (pH7.5), 50 mM KCl, 35 mM (NH4)2SO4, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM DTT, 50% (v/v) Glycerol.

10X Reaction Buffer:500 mM Tris-HCl (pH 7.5 at 25℃), 20 mM MgCl2, 10 mM DTT, 4 mM ATP.

失活或抑制:85℃加热5min可使T4 RNA Ligase 2失活,或加入蛋白酶K或EDTA可抑制其活性。

包装清单:
产品编号 产品名称 包装
R0632S-1 T4 RNA Ligase 2 (10U/µl) 100µl
R0632S-2 10X T4 Rnl2 Reaction Buffer 250µl
说明书 1份
保存条件:

-20℃保存,至少一年有效。

注意事项:

如果连接底物为ssRNA,推荐使用碧云天生产的R0621 T4 RNA Ligase 1等系列产品。

可根据具体应用选择合适的操作方法,可能需准备额外的试剂,如RNase InhibitorDEPC水等。

本产品提供的T4 Rnl2 Reaction Buffer (10X)适用于RNA双链中缺刻的连接反应。如果用于RNA/DNA杂合链中RNA 3'羟基与DNA 5'磷酸基的缺刻连接时,需要将反应体系中的MgCl2的终浓度提高至10mM,并在反应体系中加入终浓度为10-15%的PEG8000,这样可以显著提高酶活性,同时不影响反应特性。

本产品仅限于专业人员的科学研究用,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品,不得存放于普通住宅内。

为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用说明:
1.双链RNA或DNA/RNA杂合双链的退火。

将两条单链RNA等摩尔数混合,推荐的终浓度为20µM (10-50µM均可),90℃孵育1min,然后通过梯度降温至25℃退火形成dsRNA。推荐使用碧云天生产的R0051 Annealing Buffer for RNA oligos (5X),并按照该产品使用说明进行退火反应。DNA和RNA杂合链的退火也可以参考双链RNA的退火条件进行。退火后的双链推荐在-80℃保存。

2.对于双链RNA缺刻的连接,参考下表在冰浴中配制如下反应体系:
Reagent Volume Final Concentration
DEPC-treated Water 16µl -
Nicked dsRNA Substrate (20µM) 1µl 1µM
10X T4 Rnl2 Reaction Buffer 2µl 1X
T4 RNA Ligase 2 (10U/µl) 1µl 0.5U/µl
Total Volume 20µl -
注意:
a.由于涉及RNA操作,需要严格按照RNA操作的规范进行,避免RNase污染,相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。本反应体系中涉及双链RNA,双链RNA可以耐受RNase A和T1等。如果涉及单链RNA,包括双链退火后存在部分RNA序列是单链的情况,推荐适量添加R0102 RNase Inhibitor
b.如果同时进行多个连接反应,可以把上表中除Nicked dsRNA Substrate之外的所有溶液和酶提前预混合,然后再分装到各反应管内。
c.反应体系中的Nicked dsRNA Substrate的最终浓度可以达到1µM,在该反应体系中可以确保充分连接。实际使用过程中,例如由于底物量有限等原因,可以适当减少Nicked dsRNA Substrate的用量,例如使最终浓度为0.5µM或0.2µM等。
3.对于RNA/DNA杂合链中RNA 3'羟基与DNA 5'磷酸基的缺刻连接,参考下表在冰浴中配制如下反应体系:
Reagent Volume Final Concentration
DEPC-treated Water 10.4µl -
Nicked DNA/RNA Substrate (20µM) 1µl 1µM
10X T4 Rnl2 Reaction Buffer 2µl 1X
PEG8000 (50%, RNase Free) 4µl 0.1
MgCl2 (100mM, DEPC-treated) 1.6µl 8mM
T4 RNA Ligase 2 (10U/µl) 1µl 0.5U/µl
Total Volume 20µl -
注意:
a.由于涉及RNA操作,需要严格按照RNA操作的规范进行,避免RNase污染,相关试剂和耗材需要经过DEPC处理去除RNase或者确保是RNase free的。本反应体系中涉及双链RNA,双链RNA可以耐受RNase A和T1等。如果涉及单链RNA,包括双链退火后存在部分RNA序列是单链的情况,推荐适量添加R0102 RNase Inhibitor
b.如果同时进行多个连接反应,可以把上表中除Nicked DNA/RNA Substrate之外的所有溶液和酶提前预混合,然后再分装到各反应管内。
c.反应体系中的Nicked dsRNA Substrate的最终浓度可以达到1µM,在该反应体系中可以确保充分连接。实际使用过程中,例如由于底物量有限等原因,可以适当减少Nicked dsRNA Substrate的用量,例如使最终浓度为0.5µM或0.2µM等。
4.连接反应:37℃孵育30min。如果发现效果欠佳可以尝试25℃孵育2h。为了使连接反应更加充分,可以适当延长连接反应时间。
5.终止反应:反应结束后加入蛋白酶K或EDTA,即可终止反应。

由于T4 RNA Ligase 2热失活需要85℃加热5min,这样可能导致dsRNA或DNA/RNA杂合双链变性,因此通常不建议通过加热方式失活T4 RNA Ligase 2。如果后续无需保持双链状态,则推荐85℃加热5min以失活T4 RNA Ligase 2。

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