使用说明：
1.样品的准备：
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟-2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g，5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
2.试剂盒的准备：
a.融解Amplex Red和检测缓冲液，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.Amplex Red反应工作液(Working Solution)的配制：按照每个反应50µl的体积配制适量的Amplex Red反应工作液。均匀混合42µl检测缓冲液(ACS Assay Buffer)、2µl Amplex Red、2µl酶溶液(Enzyme Solution)、2µl底物(Substrate)、2µl增强剂(Enhancers)，即可配制成50µl Amplex Red反应工作液(Working Solution) 。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的Amplex Red反应工作液。具体配制方法参考下表。配制好的Amplex Red反应工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	10	20	50
ACS Assay Buffer (µl)	42	420	840	2100
Amplex Red (µl)	2	20	40	100
Enzyme Solution (µl)	2	20	40	100
Substrate (µl)	2	20	40	100
Enhancers (µl)	2	20	40	100
Working Solution (µl)	50	500	1000	2500

注1：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
注2：乙酰辅酶A和H2O2的存在会对乙酰辅酶A合成酶的检测产生干扰。如果样品含有乙酰辅酶A和H2O2，需同时设置样品的背景对照，加入不含底物的Amplex Red反应工作液，即在配制Amplex Red反应工作液时2µl底物用检测缓冲液替代。计算时样品孔的读数值需要减去背景对照孔的读数。
3.样品测定：
a.乙酰辅酶A合成酶(ACS)标准曲线设置(吸光度检测或荧光检测，可选取其中的一种，对于样品量较少或活性很低的情况，优先推荐采用荧光检测)。
(a)吸光度检测：取10μl ACS标准溶液(10U/ml)，加入190μl检测裂解液或检测缓冲液(如果检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织样品，可以使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay；如果检测血液、上清等无需处理的样品，可以用检测缓冲液)，混匀，配制成浓度为500mU/ml的ACS溶液。分别取500mU/ml的ACS溶液0、2、5、10、20、50μl加入96孔板的标准品孔中，并相应地用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或检测缓冲液补足到50μl，此时，标准曲线的浓度分别为0、20、50、100、200、500mU/ml。
注：吸光度检测时建议使用透明96孔板(FPT010/FPT011)。
(b)荧光检测：取2μl ACS标准溶液(10U/ml)，加入198μl检测裂解液或检测缓冲液(如果检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织样品，可以使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay；如果检测血液、上清等等无需处理的样品，可以使用检测缓冲液)，混匀，配制成浓度为100mU/ml的ACS溶液。分别取100mU/ml的ACS溶液0、2.5、5、10、25、50μl加入96孔板的标准品孔中，并相应地用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或检测缓冲液补足到50μl，此时，标准曲线的浓度分别为0、5、10、20、50、100mU/ml。
注：荧光检测时建议使用96孔黑板(FCP965/FCP966)。
b.取1-50μl样品或稀释后的样品至96孔板样品孔中，并相应地加入裂解液或检测缓冲液至样品孔中，补足至50µl。同时设置仅含裂解液或检测缓冲液的孔为空白对照。
注：为确保数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品设置多个稀释倍数，以确定样品中ACS活性的大致水平，如果数值不在标准曲线范围内，请调整样品的稀释倍数或者增加样品的量。如果检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织裂解样品，请使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay 稀释；如果检测血液、上清等无需裂解处理的样品，可以使用检测缓冲液稀释。样品总稀释倍数记为n(例如本步骤中对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为25µl，则n=10×50/25=20)。
c.各孔加入Amplex Red反应工作液50µl，混匀，37ºC反应30分钟。
注：反应工作液加入后，随着孵育时间的延长，各反应孔会呈现出反应特有的粉红色，颜色深浅和孔中乙酰辅酶A的酶活性成正比，反应时间可以根据辅酶A合成酶的活性高低灵活调整。如果颜色较深，表明吸光度较高或荧光较强，可适当缩短反应时间，例如反应15或20分钟；如果颜色较浅，表明吸光度偏低或荧光偏弱，可适当延长反应时间，例如反应45或60分钟。
d.如果使用吸光度检测，测定A570；如果使用荧光检测，设置激发波长为560nm，发射波长为590nm进行荧光强度检测。
e.建立标准曲线，并计算样品中乙酰辅酶A合成酶活性A，如果样品背景对照孔信号值比较高，样品的信号值需要减去样品背景对照孔的信号值。乙酰辅酶A合成酶标准曲线可以参考图2，吸光度检测在10-500mU/ml活性范围内有良好的线性关系，荧光检测在1-100mU/ml浓活性范围内有良好的线性关系。乙酰辅酶A合成酶酶活性的计算公式如下：
C (mU/ml) = A × n
注：A为步骤3e根据标准曲线确定的乙酰辅酶A合成酶酶活性；
n为步骤3b样品总稀释倍数。
乙酰辅酶A合成酶酶活力单位的定义：1个酶活力单位(unit, U)在37ºC条件下，在1分钟内可以催化产生1µmol乙酰辅酶A。
参考文献：
1.Starai VJ, Escalante-Semerena JC. Cell Mol Life Sci. 2004. 61(16):2020-30.
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