使用说明：
1.样品的准备：
a.血液样品的准备：对于血清样品，将全血在常温如25ºC下放置30分钟至2小时，不要剧烈摇晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黄色沉淀；对于血浆样品，将全血用肝素或者EDTA进行抗凝，4ºC约1000-2000×g离心10分钟，取黄色或淡黄色上清即得血浆，注意不要吸取白色沉淀。血清和血浆都需置于冰上，如果不能立即检测，也可以分装并短期保存于-20ºC或-80ºC。对于冻存的样品，在检测前解冻后冰浴存放备用，使用前必须混匀。
b.细胞或组织样品的准备：对于培养的贴壁细胞，PBS (C0221A)洗涤一次并吸净残留液体。对于培养的悬浮细胞，先适当离心(如100-500×g, 5分钟)收集细胞到离心管内，弃上清并吸净残留液体。按照每100万细胞加入100-200μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例加入裂解液，适当吹打，冰浴5-10分钟以充分裂解细胞。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。对于组织样品，按照每10mg组织加入100μl BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay的比例，使用TissueMaster™高通量组织研磨仪(1.5/2ml×48) (E6618)、TissueMaster™手持式组织研磨仪(E6600)或玻璃匀浆器在约4ºC或冰浴等低温条件下进行匀浆。4ºC约12,000×g离心3-5分钟，取上清用于后续检测。以上所有操作均需在4ºC或冰上操作。制备好的细胞或组织样品如果不能立即检测，可以-20ºC或-80ºC冻存。
c.细胞培养上清样品的准备：对于贴壁细胞，直接取培养液；对于悬浮细胞，离心取培养液。
2.试剂盒的准备：
a.融解BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay、检测缓冲液、显色液和底物，平衡至室温后混匀备用。其它试剂存放于冰浴备用，使用完毕后宜立即按照试剂盒要求的条件保存。
b.显色工作液(Working Solution)的配制：按照每个检测反应80μl的体积配制适量的显色工作液。均匀混合74μl检测缓冲液(Malate Assay Buffer)、2μl酶溶液(Enzyme Solution)、2μl显色液(Chromogen Solution)、2μl底物(Substrate)，即可配制成80μl显色工作液(Working Solution)。根据待检测样品(包括标准品)的数量，配制适量的显色工作液。具体配制方法参考下表。配制好的显色工作液如果置于4ºC或冰浴避光保存，可以在当天使用，但建议尽量现配现用。

Samples	1	10	20	50
Malate Assay Buffer (μl)	74	740	1480	3700
Enzyme Solution (μl)	2	20	40	100
Chromogen Solution (μl)	2	20	40	100
Substrate (μl)	2	20	40	100
Working Solution (μl)	80	800	1600	4000

注1：由于酶溶液的用量较少且易沉降，必须注意在使用前先轻轻离心一下，然后适当混匀后再使用。
注2：当样品有背景会对检测产生干扰时，需同时设置样品背景对照孔，加入不含酶溶液的显色工作液，即配制显色工作液时2µl酶溶液用检测缓冲液替代。计算时样品孔的读数需要减去样品背景对照孔的读数。
3.样品测定：
a.苹果酸标准曲线设置：取25μl苹果酸标准溶液(10mM)，加入475μl检测裂解液或检测缓冲液(如果检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织裂解样品，使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay；如果检测血液、上清等无需裂解处理的样品，使用检测缓冲液)，混匀，配制成浓度为500μM的苹果酸标准溶液。分别取500μM的苹果酸标准溶液0、1、2、4、8、20μl加入96孔板的标准品孔中，并用对应的BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay或检测缓冲液补足到20μl，此时标准曲线的浓度为0、25、50、100、200、500μM。
b.加入1-20μl样品或稀释后的样品到96孔板样品孔中，并相应地再加入检测裂解液或检测缓冲液至样品孔中，补足到20µl。同时设置仅含裂解液或检测缓冲液的孔为空白对照孔。
注：为确保数值在标准曲线范围内，建议进行预实验将样品同时设定多个稀释倍数，以确定样品的大致浓度。如果数值不在标准曲线范围内，可调整样品的稀释倍数或者增加样品的量。如果检测BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay制备的细胞或组织裂解样品，使用BeyoLysis™ Buffer A for Metabolic Assay稀释样品；如果检测血液、上清等无需裂解处理的样品，使用检测缓冲液稀释。此处的样品总稀释倍数记为n (例如本步骤中对样品进行了10倍稀释，加入的“稀释后的样品”为10µl，则n=10×20/10=20)。
c.各孔加入显色工作液80μl，混匀，37ºC反应30分钟。
注：如果吸光度偏低，可适当延长反应时间，例如反应45或60分钟。
d.在450nm测定吸光度。
e.建立标准曲线，并计算样品中L-苹果酸的浓度(记录为A)，如果样品背景对照孔吸光度比较高，样品的吸光度需要减去样品背景对照的吸光度。L-苹果酸标准曲线可以参考图2，在20-500μM浓度范围内有良好的线性关系。L-苹果酸浓度的计算公式如下：
C (μM) = A × n
注1：A为步骤3e根据标准曲线确定的稀释后的样品L-苹果酸浓度(μM)；
n为步骤3b样品总稀释倍数；
注2：计算获得的L-苹果酸浓度其中包含了L-苹果酸和L-苹果酸根的摩尔浓度，也可以理解为包含了L-苹果酸和L-苹果酸盐的摩尔浓度。上述仅为了表述方便，仅描述为L-苹果酸。如有必要，可根据L-苹果酸的分子量134.09计算出样品中L-苹果酸的质量浓度(μg/ml) = C × 0.13409
参考文献：
1.Duarte A M, Caixeirinho D, Miguel M G, et al. Acta Horticulturae. 2010. 933: 601-606.
2.Jensen W B. Journal of Chemical Education. 2007. 84(6): 924.
3.Takeya M, Ito S, Sukigara H, Osanai T. Front Plant Sci. 2018.13(9):947.
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