产品简介:
Klenow Fragment,又称Klenow片段,是大肠杆菌聚合酶I(E.coli.DNA polymerase I)的大片段(Large Fragment)。Klenow Fragment保留了DNA聚合酶I的5'→3'聚合酶活性和3'→5'外切酶活性,但缺少完整的Klenow酶的5'→3'外切酶活性。Klenow Fragment的3'→5'外切酶活性保证了其合成DNA时的准确性(proofreading)。
特点:对于5'突出或3'突出的粘末端都可以催化产生平末端,用于后续的平端连接。
用途:双链DNA 5'突出(5'overhang)末端的补平(fill-in);双链DNA 3'突出(3'overhang)的打平(也称削平);5'突出末端的标记;随机引物法进行DNA标记;Sanger双脱氧法进行DNA测序;cDNA第二链的合成或定点突变反应第二链的合成。
来源:由大肠杆菌表达,表达基因的来源为polA 基因片段。
分子量:约68kDa(单体)。
活性定义:37℃30分钟时间内,催化10nmol脱氧核糖核苷酸(dNTPs)摻入到多聚核苷酸中所需的酶量定义为1个活性单位。
酶活性检测条件:67mM potassium phosphate(pH7.4),6.7mM MgCl2,1mM 2-mercaptoethanol,0.033mM dATP,0.033mM dTTP,0.4MBq/ml[3H]-dTTP,62.5μg/ml poly(dA-dT)·poly(dA-dT)。
纯度:不含DNA内切酶,不含RNase。
酶储存溶液:25mM Tris-HCl(pH7.5),0.1mM EDTA,1mM DTT,50%(v/v)glycerol。
Reaction Buffer(10X):500mM Tris-HCl(pH8.0 at 25℃),50mM MgCl2,10mM DTT。
缓冲液兼容性:在碧云天的内切酶反应缓冲液1X O、1X R、1X Y、2X Y中的活性为100%,在1X B、1X G中的活性为100%;在碧云天的Taq、Pfu DNA polymerase和M-MuLV反应缓冲液中的活性为100%。
失活或抑制:75℃加热10分钟或加入适量EDTA均可导致Klenow Fragment失活。金属离子螯合剂,无机焦磷酸盐(PPi),大剂量的无机磷酸盐(Pi)均对Klenow Fragment有抑制作用。
包装清单:
产品编号 |
产品名称 |
包装 |
D7035-1 |
Klenow Fragment(2U/μl) |
100U |
D7035-2 |
Reaction Buffer(10X) |
0.3ml |
- |
说明书 |
1份 |
保存条件:
-20℃保存。
注意事项:
酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上,使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明:
1. 双链DNA 5'突出(5'overhang)末端的补平:
a. 参考如下表格设置反应体系:
Digested DNA |
10~15μl(0.1~4μg) |
Reaction Buffer(10X) |
2μl |
dNTP Mixture(2.5mM each) |
0.4μl |
Klenow Fragment |
0.5~2μl(1~4U) |
补充无核酸酶的去离子水 |
至20μl |
b. 按上表设置好反应体系后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后
离心沉淀液体。
c. 37℃孵育10分钟。
d. 75℃孵育10分钟终止反应。
2. 双链DNA 5'突出(5'overhang)末端的标记:
a. 参考如下表格设置反应体系:
Digested DNA |
10~15μl(0.1~4μg) |
Reaction Buffer(10X) |
2μl |
[α-32P]-dNTP, ~15-30 TBq/mmol(400-800Ci/mmol)
(400-800 Ci/mmol) |
0.74 MBq(20μCi)
(20 μCi) |
或[α-32P]-dNTP, ~110 TBq/mmol(3000Ci/mmol)
(3000 Ci/mmol) |
2.96 MBq(80μCi) |
3 dNTP Mixture(2.5mM each , without the labeled dNTP) |
2μl |
Klenow Fragment |
0.5μl(1U) |
补充无核酸酶的去离子水 |
至20μl |
b. 按上述体系配好之后,轻轻混匀(可以用移液器吹打混匀或用Vortex在最低速度轻轻混匀),随后离心
沉淀液体。
c. 30℃孵育15分钟。
d. 75℃孵育10分钟终止反应。
3. 其他用途可以参考上述用途或适当的文献资料进行。