碧云天讲堂：肿瘤发生的标志性事件（一）
写在前面
最近，由于央视名嘴李咏因癌去世，再次将癌症的讨论推上热搜。肿瘤研究工作者一直潜心研究，争取早日攻克癌症这一威胁人类健康的难题。
肿瘤细胞十个特征
目前，研究者对于癌症的认识，是基于识别癌细胞和同源的正常细胞之间的表型差异。近年来兴起的基因组、蛋白组和表观基因组研究获得的高通量对比数据依然将矛头指向大多数肿瘤发展所共有的十大特征。
2000年Douglas Hanahan和Robert A. Weinberg在Cell上发表文章The Hallmarks of Cancer，介绍了肿瘤细胞的六大基本特征：维持增殖信号；逃避生长抑制因子；持续复制能力；激活侵袭与转移；诱导血管生成；抵抗细胞死亡。这篇论文被称为肿瘤学研究的经典论文，到目前为止，已经被引用了上万次。
2011年3月Douglas Hanahan和Robert A. Weinberg在Cell上发表文章Hallmarks of Cancer: The Next Generation，简述了最近10年肿瘤学中的热点和进展，在原有的六大特征的基础上，新增了四大特征，包括：避免免疫破坏、促进肿瘤的炎症、细胞能量异常和基因组不稳定和突变，将原有的肿瘤细胞六大特征扩增到了十个。
| 1、维持增殖信号（sustaining proliferative signaling） | 2、逃避生长抑制因子（Evading growth suppressors） | |
| 3、避免免疫破坏(Avoiding immune destruction ) | 4、持续复制能力(Enabling replicative immortality) | |
| 5、促进肿瘤的炎症(Tumor-promoting inflammation) | 6、激活侵袭和转移(Activating invasion & metastasis) | |
| 7、诱导血管生成(Inducing angiogenesis) | 8、基因组不稳定和突变（Genome Instability and Mutation） | |
| 9、抵抗细胞死亡（Resisting cell death） | 10、细胞能量异常（Deregulating Cellular Energetics） |
其中Resisting cell death与细胞凋亡密切相关；而sustaining proliferative signaling，Evading growth suppressors，Enabling replicative immortality则与细胞增殖密不可分；所以接下来的几期我们对于肿瘤与癌症发生的标志性事件会通过细胞凋亡、细胞增殖、血管生成、促进肿瘤的炎症以及细胞能量异常这5个方面展开讲解。
细胞凋亡的概念及意义
细胞凋亡(Apoptosis)是指细胞为了维持内环境的稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡，是一种最典型的细胞程序性死亡(Programmed Cell Death)。
对细胞凋亡的逃逸能力，是绝大多数肿瘤细胞的特征。许多蛋白，包括细胞表面受体、配体、蛋白酶和有丝分裂组分，调节着细胞的生存与死亡的精细平衡。在癌症中，这些感应分子或作用分子的突变，会破坏这个平衡，从而逃脱凋亡的调控。
细胞凋亡的过程及形态学特征
细胞凋亡大致分为3个阶段：早期、中期和晚期。
凋亡早期，细胞膜改变，磷脂酰丝氨酸外翻（荧光标记Annexin V染色阳性），起始Caspase被激活（如Caspase-8，Caspase-9），线粒体膜电位发生改变（JC-1等染色发生变化），线粒体细胞色素c (Cyt c)释放；
凋亡中期：效应Caspase被激活（如Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9），细胞内的一些蛋白（PARP、死亡底物等）被caspase切割；
凋亡晚期：DNA断裂（呈现DNA ladder，TUNEL染色阳性），形成凋亡小体，凋亡小体被吞噬细胞吞噬。
随着上述细胞凋亡行为过程的发展，在细胞形态上会发生明显的变化。细胞核内染色质固缩（condensation）、染色质边缘化（margination）、细胞核内胞浆紧实（compaction）以及细胞核的核膜折叠（fold）；然后核膜核仁破碎；细胞凋亡晚期，细胞核最终裂解为碎块，产生凋亡小体（Apoptotic body），被吞噬为吞噬体（phagosome），进而转化为溶酶体残留小体（lysosomal rApoptotic bodyesidual body），完成整个细胞凋亡过程。
细胞凋亡过程中的关键因子
细胞凋亡机制复杂，涉及的分子众多，其中最关键的分子是Caspase家族和Bcl-2家族。
Caspase英文全称是 cysteine-dependent aspartate-specifc proteases，中文名称为胱天蛋白酶或半胱天冬酶，是一组存在于胞质溶胶中的半胱氨酸蛋白酶。能够特异性切割含有天冬氨酸（Asp）的多肽底物，选择性地对多种信号转导途径中的蛋白质进行高效切割。
根据其蛋白酶序列的同源性可分为3大类：
- 促凋亡Caspases，根据在细胞凋亡过程中发挥的功能不同，又分为两类，起始Caspases，包括Caspase-2，-8，-9，-10，-11，负责对效应者的前体进行切割；效应Caspases，包括Caspase-3，-6，-7，负责切割细胞核及细胞质中的结构蛋白和调节蛋白，保证凋亡程序正常进行。
- 促炎性Caspases，包括Caspase-1，4，5，11，12，13。
- 角化细胞分化，Caspase-14参与角化细胞的分化，但不会在炎症或细胞凋亡中发挥重要作用。
Bcl-2（B-cell lymphoma-2）家族成员具有较高的同源性，所有成员均含有一个或多个BH（Bcl-2 homology)结构域，依次命名为BH1、BH2、BH3和BH4。
根据结构和功能，Bcl-2家族成员分为3个亚族：
- Bcl-2亚家族：大多具有4个BH结构域BH1-4，抑制细胞凋亡，包括：Bcl-2、Bcl-XL、Bcl-w、Mcl-1、CED-9等；
- Bax亚家族：具有3个BH结构域BH1-3，促进细胞凋亡，包括：Bax、Bak、Bok；
- BH3亚家族：仅有BH3结构域，促进细胞凋亡，包括：Bad、Bik、Bid、Puma、Noxa等。
细胞接受凋亡信号后促凋亡因子Bax和Bak发生寡聚化，从细胞质中转移到线粒体外膜上，并于膜上的电压依赖性阴离子通道（VDAC）相互作用，使通道开放到足以使线粒体内的凋亡因子如细胞色素c(Cyt c)等释放到细胞质中，引起细胞凋亡。
细胞凋亡的相关信号通路
细胞凋亡因启动阶段的不同，分为3条主要的通路：
1. 线粒体通路
死亡信号激活含BH3结构域的Bcl-2家族成员后，可使胞浆中的Bcl-2家族成员发生寡聚化并插入线粒体膜，引起线粒体膜通透性改变，跨膜电位丢失，释放细胞色素c(Cyt c)和其他蛋白。
Cyt c的释放是线粒体凋亡路径的关键限速步骤，它可与凋亡蛋白酶活化因子 (Apaf-1)形成多聚复合体，并通过Apaf-1氨基端的Caspase募集结构域 (CARD) 招募胞质中的Caspase-9前体，并使其自我剪切活化启动Caspase级联反应，如激活下游的Caspase-3和Caspase-7，从而诱导细胞凋亡。
2. 内质网通路
内质网通路有两个途径引起细胞凋亡，PERK通路和caspase7通路。
Caspase7通路：内质网是细胞内蛋白质合成的主要场所，同时也是Ca2+的主要储存库。内质网Ca2+平衡的破坏或者内质网蛋白的过量积累是关键步骤，它们会诱导位于内质网膜的Caspase-12的表达，同时诱导胞质的 Caspase-7 转移到内质网表面。Caspase-7可激活Caspase-12，而激活的Caspase-12 可进一步剪切Caspase-3 从而引发细胞凋亡。
另一方面，PERK全名叫蛋白激酶R样内质网激酶，潜伏于内质网膜上，PERK激活后促进真核起始因子eIF2a磷酸化，eIF2a被磷酸化，就能抑制细胞中蛋白质的合成，同时通过活化转录活化因子4（ATF4)上调CHOP基因的表达，活化细胞凋亡途径。
3. 死亡受体通路
死亡受体通路就是各种外界因素作为细胞凋亡的启动剂，然后通过不同的信号传递系统传递凋亡信号，引起细胞凋亡。死亡受体为一类跨膜蛋白，属肿瘤坏死因子受(TNFR)基因超家族，其胞外部分都含有一富含半胱氨酸的区域 ,胞质区有一由同源氨基酸残基构成的结构，有蛋白水解功能，称“死亡结构域”(deathdomain，DD)。具有蛋白水解功能，可传递死亡信号启动细胞凋亡。
已知的死亡受体有五种：
- TNFR-1 (又称CD120a或p55)；
- Fas(又称为CD95或Apo1)；
- DR3(死亡受体3 death receptor 3，又称 Apo3)；
- DR4(死亡受体4，又被称为TRAIL-R1)；
- DR5(死亡受体5，又被称为Apo2，TRAIL-R2)
TNFR-1，Fas，DR3受体相应的配体分别为TNF，FasL (CD95L)，Apo-3L (DR3L)，DR4和DR5的配体均为Apo-2L (TRAIL)。例如配体 FasL可首先诱导 Fas 三聚体化，三聚化的Fas 和 FasL 结合后，使三个Fas 分子的死亡结构域相聚成簇，吸引了胞浆中另一种带有相同死亡结构域的蛋白FADD，在细胞膜上形成凋亡诱导复合物，从而激活Caspase8，进而引起随后的级联反应，细胞发生凋亡。
检测细胞凋亡的方法
形态学检测
以显微镜观察细胞甚至是亚细胞层面的形态变化和形态学特征，有些染料如台盼兰（trypan blue）、碘化丙啶无法进入活细胞，但可使死细胞着色。DAPI、Hoechst 33342和Hoechst 33258等与DNA结合的荧光染料，可以染色细胞核，因此借助荧光显微镜，可以观察到细胞核的形态变化。吉姆萨（Giemsa）染色法可以使染色质着色，便于在普通光学显微镜下观察到染色质固缩、细胞核碎裂、凋亡小体的形成等过程。
碧云天相关产品列表：
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| C1002 | DAPI | 5mg/ml×0.2ml |
| C1005 | DAPI染色液 | 10ml |
| ST511 | Propidium Iodide/碘化丙啶 | 5mg |
| C1011 | Hoechst 33258 | 10mg |
| C1022 | Hoechst 33342 | 10mg |
| C1052 | 细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒 | 50次 |
| C1056 | 细胞凋亡与坏死检测试剂盒 | 100次 |
| ST798 | Trypan blue | 1g |
流式细胞仪检测
与正常的二倍体细胞相比，凋亡细胞DNA发生断裂或丢失，呈亚二倍体状态。采用PI染色使DNA产生激发荧光，流式细胞仪能够检测出凋亡的亚二倍体细胞。
Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 货号：C1062
注：Annexin V-/PI- 正常细胞；Annexin V+/PI- 早期凋亡细胞；Annexin V+/PI+ 坏死细胞
碧云天相关产品列表：
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| C1062 | Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒 | 20次 |
| C1065S | Annexin V-PE细胞凋亡检测试剂盒 | 20次 |
| C1067S | Annexin V-EGFP细胞凋亡检测试剂盒 | 20次 |
DNA电泳检测（DNA ladder）
细胞凋亡时，细胞内特异性核酸内切酶活化，染色质DNA在核小体间被特异性切割，DNA降解成180--200bp或其整数倍片段，因此凋亡细胞中提取的DNA在进行常规的琼脂糖凝胶电泳时，这些大小不同的DNA片段就呈现出梯形条带（DNA ladders）这一方法是鉴定细胞凋亡最为简单可靠的方法之一。
细胞凋亡－DNA Ladder抽提试剂盒(离心柱式) 货号：C0008
碧云天相关产品列表：
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| C0007 | 细胞凋亡-DNA Ladder抽提试剂盒 | 50次 |
| C0008 | 细胞凋亡－DNA Ladder抽提试剂盒(离心柱式) | 50次 |
DNA断裂的原位末端标记法
即TUNEL法，这一方法能对DNA分子断裂缺口中的3'-OH进行原位标记。正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，从而没有3'-OH形成，很少能够被染色；而凋亡细胞的核DNA断裂后产生3'-OH末端，因此可借助一种可观测的标记物如荧光素对单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，用荧光显微镜进行观察。
一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(绿色荧光)货号：C1086
碧云天相关产品列表：
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| C1082 | TUNEL检测阳性对照制备试剂盒 | 10次 |
| C1086 | 一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(绿色荧光) | 20次 |
| C1089 | 一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(红色荧光) | 20次 |
| C1091 | TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(显色法) | 20次 |
Western Blot检测关键蛋白（抗体）
细胞发生凋亡时，与细胞凋亡相关的蛋白表达水平发生变化。通常以western blot检测凋亡通路明星蛋白，如线粒体通路中的Caspase-9和Caspase-3，前体分子Pro-caspase-9和Pro-caspase-3以及Caspase-3的底物PARP分子；死亡受体凋亡通路中的Fas、FasL、TNF和TNFR；FasL-Fas通路以及TNF-TNFR通路中的FADD分子。
碧云天相关产品列表：
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| AF1243 | Caspase-8 Rabbit Monoclonal Antibody | 50μl |
| AF1264 | Caspase-9 Rabbit Monoclonal Antibody | 50μl |
| AF1657 | PARP Rabbit Monoclonal Antibody | 50μl |
| AF1567 | Cleaved PARP Rabbit Monoclonal Antibody | 50μl |
| AF2047 | Cytochrome C Rabbit Monoclonal Antibody | 50μl |
| AF0054 | BAX Mouse Monoclonal Antibody | 50μl |
| AF0057 | BAX Rabbit Polyclonal Antibody | 50μl |
| AF0060 | Bcl-2 Rabbit Polyclonal Antibody | 50μl |
| AF0072 | BMI1 Mouse Monoclonal Antibody | 50μl |
| AF0081 | Caspase-3 Rabbit Polyclonal Antibody | 50μl |
| AF0144 | ERK1 Rabbit Polyclonal Antibody | 50μl |
| AF0147 | ERK2 Rabbit Polyclonal Antibody | 50μl |
| AF0168 | GRB2 Rabbit Polyclonal Antibody | 50μl |
| AF0177 | HER2/ErbB2 Rabbit Polyclonal Antibody | 50μl |
| AF0216 | LDHA Rabbit Polyclonal Antibody | 50μl |
| AF0219 | LMNB2 Rabbit Polyclonal Antibody | 50μl |
| AF0222 | MAPK14 Mouse Monoclonal Antibody | 50μl |
| AF0270 | PUMA Rabbit Polyclonal Antibody | 50μl |
| AF0273 | Ras Rabbit Polyclonal Antibody | 50μl |
| AF603 | FoxO1抗体(兔单抗) | 50μl |
| AF605 | Phospho-FoxO1 (Thr24)/FoxO3a (Thr32)抗体(兔多抗) | 50μl |
| AF609 | FoxO3a抗体(兔单抗) | 50μl |
其他检测方法
此外还可以借助其他的生理生化方法检测细胞凋亡，如Caspase激活、Cyt c的释放、线粒体膜电位的变化等。
GreenNuc™活细胞Caspase-3活性检测试剂盒 货号：C1168
注：最左侧正常细胞组，中间诱导细胞凋亡组，凋亡细胞细胞核处显绿色萤光；最右侧的使用Caspase抑制剂预处理，无绿色萤光。
注：细胞未发生凋亡，呈红色荧光，细胞发生凋亡，膜电位降低，产生绿色荧光。
碧云天相关产品列表：
| 产品编号 | 产品名称 | 产品包装 |
| C1168M | GreenNuc™活细胞Caspase-3活性检测试剂盒 | 100-200次 |
| C1101 | Caspase 1 活性检测试剂盒 | 20次 |
| C1107 | Caspase 2 活性检测试剂盒 | 20次 |
| C1115 | Caspase 3 活性检测试剂盒 | 20次 |
| C1121 | Caspase 4 活性检测试剂盒 | 20次 |
| C1135 | Caspase 6 活性检测试剂盒 | 20次 |
| C1151 | Caspase 8 活性检测试剂盒 | 20次 |
| C1157 | Caspase 9 活性检测试剂盒 | 20次 |
| C1202-0.02ml | Caspase抑制剂Z-VAD-FMK | 20mM×0.02ml |
| C1206-5mg | Caspase 3抑制剂Ac-DEVD-CHO | 5mg |
| C2005 | JC-1 | 1mg |
| C2006 | 线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1) | >100次 |
| C2007 | Rhodamine 123 | 5mg |