免疫染色实验方法和步骤/immunol staining protocol/immunol fluorescence protocol/免疫组化方法/免疫细胞化学方法

                            免疫染色实验方法和步骤
    免疫染色(immunol staining)包括免疫荧光(immunol fluorescence)、免疫组化(immunol histochemistry)、免疫细胞化学(immunol cytochemistry)等，可以参考如下步骤进行操作。
1. 样品准备(Sample preparation)
   对于贴壁细胞：
    可以直接用多孔板，例如6孔板、24孔板等，培养细胞，然后到预定时间时进行固定等后续操作。
    也可以用洁净的盖玻片，70%乙醇中浸泡后，用无菌的镊子放置到6孔板内，然后用无菌的生理盐水、PBS或培养液洗去残留的乙醇。这时就可以种入细胞进行培养，待细胞贴在盖玻片上生长良好后，即可进行固定等后续操作。
   对于悬浮细胞：
    把细胞先在固定液中固定，然后把细胞滴加在载玻片上，干燥后细胞会紧贴在载玻片上。然后就可以进行后续操作。如果细胞的粘附能力不佳，可以在载玻片上用PDL等物质进行处理，以增强载玻片的粘附能力。
   对于冷冻切片：
    切片放置在载玻片上后，可以直接进行固定等后续操作。
   对于石蜡切片：
    脱蜡：切片在二甲苯中脱蜡5分钟，再换用新鲜的二甲苯脱蜡，共用二甲苯脱蜡3次。无水乙醇5分钟，两次。90%乙醇5分钟，两次，70％乙醇5分钟，一次。蒸馏水5分钟，两次。
    抗原修复：根据不同的抗原和抗体，可以选择把切片放置在如下抗原修复液中，10mM柠檬酸钠，pH6.0，或1mM EDTA，pH8.0，或10mM Tris, pH10.0，95℃加热12分钟，大约在30分钟内缓慢冷却至室温。
2. 固定
    可以使用适当的固定液固定细胞或切片，例如碧云天生产的免疫染色固定液(P0098)。固定完毕后，可以用免疫染色洗涤液(P0106)洗涤两次，每次5分钟。
3. 封闭(Blocking)
    加入免疫染色封闭液(P0102)，封闭60分钟。如果背景较高，可以4℃封闭过夜。
    从封闭开始所有的步骤，一定要注意样品的保湿，避免样品的干燥，否则极易产生较高的背景。
    在整个免疫染色过程中我们推荐使用碧云天的侧摆摇床(ESHK02)，侧向摆动速度比较缓慢，而且也容易让溶液覆盖样品。如果样品比较容易脱落，也可以把所有的步骤放置在桌面上静止进行，即封闭、抗体孵育、洗涤等步骤均不需摇动，但静止操作时宜适当延长作用时间或次数。
4. 一抗孵育(Primary antibody incubation)
    参考一抗的说明书，按照适当比例用免疫染色一抗稀释液(P0103)稀释一抗。
    用微型台式真空泵(EVAC06/EVAC07)吸尽封闭液，立即加入稀释好的一抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。如果一抗孵育一小时效果不佳，可以4℃缓慢摇动孵育过夜。
    回收一抗。加入免疫染色洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
5. 二抗孵育(Secondary antibody inucubation)
    参考二抗的说明书，按照适当比例用免疫荧光染色二抗稀释液(P0108)稀释荧光标记的二抗，或者用免疫染色(非荧光)二抗稀释液(P0110)稀释辣根过氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或碱性磷酸酯酶(AP)标记的二抗。辣根过氧化物酶(A0201/A0208/A0216)可向碧云天订购。
    用微型台式真空泵吸尽洗涤液，立即加入稀释好的二抗，室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。
    回收二抗。加入免疫染色洗涤液，在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后，再加入洗涤液，洗涤5分钟。共洗涤3次。如果结果背景较高，可以适当延长洗涤时间并增加洗涤次数。
6. 蛋白检测(Detection of proteins)
    对于免疫荧光染色，此时已经可以直接到荧光显微镜下观察。
    对于非免疫荧光染色可以选用DAB等适当的显色底物，或AB检测体系等进行后续检测。
7. 多重染色(Multiple staining)
    如果进行的是免疫荧光染色，通常都可以进行多重染色。对于可以产生有色沉淀物的染色反应，例如DAB染色，一般不适合再进行多重染色。
    多重荧光染色：
    可使用红色荧光、绿色荧光和蓝色荧光进行三重荧光染色。例如用免疫荧光染色试剂盒-抗小鼠Cy3(P0193)进行红色荧光染色，随后可以用免疫荧光染色试剂盒-抗兔FITC(P0186)进行绿色荧光染色，在完成上述两种染色后可以使用Hoechst染色试剂盒(C0003)对细胞核进行染色，染色后为蓝色荧光。
    用HE染色进行复染：
    免疫荧光染色后可以用苏木素伊红(HE)染色试剂盒(C0105)进行HE染色。