使用说明：
1. 引物设计：
用于特定基因突变的引物需要单独设计，请参考如下一些基本原则进行设计：
a. 共需设计两条互补的引物。可以先集中设计一条，然后就可以得到互补的另一条引物。
b. 引物的长度通常为25-45个碱基。
c. 引物中突变位点任何一侧都必需满足 4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数) ≥45。但引物也不宜过长，否则通常会形成非常稳定的二级结构。通常把突变位点两侧的碱基数控制在15个左右，且使两侧按照上述计算得到的数值相近。
例如引物为agtcaggccaattcgaagcagtcgaattgccaag，其中蓝色的aag为突变位点，则
左侧：4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)＝4X8＋2X7＝46≥45
右侧：4X(GC碱基数)＋2X(AT碱基数)＝4X8＋2X8＝48≥45
d. 在可能的情况下，尽量把引物的GC含量控制在40%-60%。
e. 在可能的情况下，尽量使引物不要产生非常稳定的二级结构和引物二聚体。二级结构和二聚体可以通过一些软件进行分析。
f. 最好使用经过PAGE纯化的引物或更高纯度的引物。
2. 引物的配制：
如果合成得到的一个引物A的量是20nmol，另外一个互补引物B的量是19nmol。在引物A中加入200微升水，配制成浓度为100μM，在引物B中加入190微升水也配制成浓度为100μM。吸取20微升100μM引物A和20微升100μM引物B到一新的离心管中，再加入160微升水，混匀后即可得到可以直接用于基因定点突变反应的引物(10μM each)。
3. 待突变模板质粒的选择：
选择GC含量在40-55%的待突变模板质粒，并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果GC含量过高，请先把目的基因克隆到其它合适的载体上，再进行基因定点突变反应。另外目的基因GC含量最好也在40-55%的范围，并且每一个50bp左右的局部GC含量最好也不超过70%。如果目的基因GC含量过高，而突变位点不在高GC含量区域，可以先把该基因的不含高GC含量的一个区域克隆出来，进行定点突变，然后再把突变后的片断克隆回原基因中。如果必需使用高GC含量的质粒模板，或者有局部高GC含量的质粒模板，请另外使用专门用于高GC含量模板的PCR反应试剂。必须使用从dam⁺的大肠杆菌(这类菌中质粒可以被甲基化)中抽提得到的质粒用于基因定点突变。常用的大部分大肠杆菌都是dam⁺的，包括DH5α、JM109等。
4. 基因定点突变反应：
a. 如下设置基因定点突变反应体系：

      按照上面的顺序依次加入各种试剂。在上述反应体系中，根据待突变模板质粒的量，计算出需加入的Nuclease-Free Water的量，使总体积为49微升。适当混匀后，加入1微升BeyoFusion? DNA Polymerase，混匀。如果用的PCR仪没有热盖，在反应体系上加入一滴矿物油(mineral oil)以防止蒸发。
b. 按照如下参数设置PCR仪：

      说明：上面表格中1分钟/kb表示，如果待突变的质粒为6kb，那么68℃的延伸时间为6分钟。
5. Dpn I消化：
PCR反应后，直接在PCR反应体系中加入1微升DpnI，混匀后37℃孵育1小时。37℃孵育可以在PCR仪上进行，也可以在水浴锅中进行。DpnI消化完毕后可以直接用于转化，或者-20℃保存备用。
6. 转化、挑克隆鉴定：
感受态细菌的转化效率必需至少在10⁷以上，否则很难得到克隆。根据所使用的感受态细菌，加入尽量多的经过DpnI消化后的突变产物用于转化。通常每100微升感受态细菌中可以加入5-10微升经过DpnI消化后的突变产物。按照所使用的感受态细菌的操作方法进行操作，在涂板前通过离心浓缩的办法，把所有被转化后的细菌，全部涂布到含有适当抗生素的平板上，培养过夜。通常会得到50个以下的克隆。如果发现克隆有上千个，那么肯定是有什么地方出了问题。对于得到的克隆，可以先挑克隆小抽酶切鉴定。以确认得到的质粒的大小和质粒中插入片断的大小与预期结果是否相符。
取3-5个酶切鉴定正确的克隆去测序，以最终确认得到的克隆是否是预期的突变克隆。通常大约每2个克隆中会得到一个预期的突变克隆。但有时也可能会因为随机因素，会测序了3-5个克隆才得到一个预期的突变克隆。
常见问题：
1. 转化后没有克隆或克隆数极少：
a. 感受态细菌效率不够高，请检测一下感受态细胞的效率，确保转化效率在10⁷以上，当然高一些更好。
b. 把DpnI消化后的产物用常规的乙醇沉淀方法进行沉淀，然后溶解在较小的体积中。这样就可以把所有的产物全部用于转化。
c. 优化基因定点突变中的PCR参数。可以把最初的95℃变性时间延长为2分钟，循环中95℃变性的时间延长至1分钟，把循环中的68℃的延伸时间改为1.5分钟/kb 至2分钟/kb，退火可以改为60-55℃或65-55℃℃等的touch down，退火时间也可以适当延长。
d. 引物设计有问题。通过突变反应中的PCR没有很好地扩增出预期的突变质粒。
e. 如果使用矿物油(mineral oil)，在转化时如果把矿物油带入感受态菌，会严重影响转化效率。
2.有克隆，但没有或很难检测到预期的突变克隆：
a. DpnI消化效果不佳。一种可能是加入DpnI后，由于该酶在甘油中，会迅速下沉，如果没有混匀就会严重影响DpnI的消化作用。另一种可能是DpnI由于保存不当或保存时间过长等原因导致活性下降，这时可以适当延长消化的时间至1.5-2小时。
b. 使用的待突变的模板质粒量过多，导致DpnI消化时不完全。我们这里推荐的模板质粒用量0.5微克，已经是模板质粒用量的上限，不能再使用更多的模板质粒了。
c. 尽量避免多次反复冻融dNTP。可以把dNTP适当分装后再使用。
3. 有突变克隆，但突变位点不是预期的位点：
a. 引物设计不佳，并且PCR反应中退火温度过低，导致引物退火到错误的地方。
b. 引物质量较差，没有经过PAGE纯化。这样引物中通常会含有比设计的引物要短的特异性较差的引物，容易导致非预期的突变。

使用本产品的文献：
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