产品简介:
碧云天生产的抗酒石酸酸性磷酸酶检测试剂盒(Tartrate Resistant Acid Phosphatase Assay Kit)是一种用于快速、便捷地检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液等样品中内源性的抗酒石酸酸性磷酸酯酶活性的试剂盒。
酸性磷酸酶(Acid Phosphatase),也称酸性磷酸酯酶,在酸性条件下可以催化磷酸酯键的水解。酸性磷酸酶是一个蛋白家族,哺乳动物中其分子量从18kD到100kD不等。酸性磷酸酶主要分为两类,一类为抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase, TRAP),一类为抗氟离子酸性磷酸酶。
抗酒石酸酸性磷酸酶是一种糖基化的含金属蛋白酶,在破骨细胞(osteoclast)和破软骨细胞(chondroclast)中高表达。在活化的巨噬细胞和神经元中也有表达。抗酒石酸酸性磷酸酶在细胞信号转导、细胞增殖和分化等方面起重要作用,也和活性氧产生和铁离子转运等有关。抗酒石酸酸性磷酸酶可以被破骨细胞释放到血液中,几乎被认为是是机体破骨活性的唯一血液指标。
在一些疾病状态下,如白血病性网状内皮组织增生症(leukaemic reticuloendotheliosis)、戈谢病(Gaucher’s disease)、艾滋病导致的脑病(HIV-induced encephalopathy)、破骨细胞瘤(osteoclastoma)、骨质疏松(osteoporosis)和代谢性骨疾病(metabolic bone disease)有关。TRAP敲除小鼠有轻微的骨骼石化症,TRAP转基因小鼠有轻微的骨质疏松。
本试剂盒可以检测细胞或组织的裂解液或匀浆液、血浆、血清、尿液或纯化的酶样品等中的抗酒石酸酸性磷酸酶活性。
Para-nitrophenyl phosphate (pNPP)是一种常用的磷酸酶显色底物,在酸性条件下,可在酸性磷酸酶作用下生成para-nitrophenol。para-nitrophenol (p-nitrophenol)在碱性条件下,呈黄色产物,可以在400-415nm检测吸光度。产物黄色越深,说明酸性磷酸酶检活性越高,反之则酶活性越低。据此通过比色分析就可以计算出酸性磷酸酶活性水平。在适量的酒石酸存在的情况下进行酸性磷酸酶的活性检测,检测得到的酸性磷酸酶活性就是抗酒石酸酸性磷酸酶活性。
包括标准品和空白对照,本试剂盒共可进行120个样品的检测。
包装清单:
产品编号 |
产品名称 |
包装 |
P0332-1 |
检测缓冲液 |
15ml |
P0332-2 |
显色底物 |
2管 |
P0332-3 |
酒石酸溶液 |
1ml |
P0332-4 |
p-nitrophenol溶液(10mM) |
0.1ml |
P0332-5 |
反应终止液 |
20ml |
— |
说明书 |
1份 |
保存条件:
-20℃保存,一年有效。显色底物和p-nitrophenol溶液需避光保存。
注意事项:
如果希望进行酶活性的绝对定量,进行酶反应时必须注意精确计时。此时推荐采用孵育30分钟等较长的时间,以减小操作过程中的时间误差。同时如果样品中酶活性较高,则可以预先适当稀释样品。
样品溶液中须避免出现各种酸性磷酸酶抑制剂。
一管显色底物配制后需当日使用完毕,因此请注意适当多准备一些样品一起检测,以避免试剂盒浪费。
p-nitrophenol溶液对人体有害,请注意适当防护。反应终止液有腐蚀性,请小心操作。
为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。
使用说明:
1. 试剂准备:将所有试剂取出,恢复至室温使用。
a. 显色底物溶液:取一管显色底物,溶解于2.5ml的检测缓冲液中,充分溶解和混匀,冰上放置。新
鲜配制的显色底物溶液需在6小时内使用。
b. 标准品工作液:取10μl p-nitrophenol溶液(10mM),用检测缓冲液稀释至0.2ml,最终浓度为0.5mM。
2. 样品准备:
a. 细胞或组织裂解液的准备:采用适当细胞或组织裂解液裂解细胞和细胞,如果有必要需进行适当匀
浆,随后离心取上清,用于抗酒石酸酸性磷酸酶的检测。注意:裂解液中不能含有磷酸酶抑制剂。样
品可以-80℃冻存,但需避免反复冻融。
b. 血浆、血清和尿液的准备:血浆和血清按照常规方法制备后可以直接用于本试剂盒的测定,但为了消
除样品本身颜色的干扰,需设置加了血浆或血清但不加底物的对照。尿液通常也可以直接用于测定。
上述样品可以-80℃冻存,但需避免反复冻融。
c. 样品的稀释:如果样品中含有较高活性的抗酒石酸酸性磷酸酯酶,可以使用原有的裂解液或PBS等进
行稀释,也可以采用试剂盒中的检测缓冲液进行稀释。如果使用试剂盒中提供的检测缓冲液进行稀
释,需注意保留足够的检测缓冲液用于试剂盒的检测过程。
3. 参考下表使用96孔板设置空白对照孔、标准品孔和样品孔。标准品的用量分别为4、8、16、24、32和40
微升,样品通常可以直接加40微升。如果样品中的抗酒石酸酸性磷酸酯酶活性过高,可以减少样品用量
或适当稀释后再进行测定。样品的检测最好能设置平行孔或三复孔。
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空白对照(Blank) |
标准品(Standard) |
样品(Sample) |
检测缓冲液 |
40μl |
(80-x)μl |
(40-y)μl |
显色底物 |
40μl |
- |
40μl |
酒石酸溶液 |
5μl |
5μl |
5μl |
样品 |
- |
- |
yμl |
标准品工作液 |
- |
xμl |
- |
4. 用枪头轻轻吹打混匀,也可借助摇床进行混匀。
5. 37℃孵育5-10分钟。(说明:待测样品中酒石酸酸性磷酸酶活性较低时,可适当延长孵育时间至30分钟)
6. 每孔加入160μl反应终止液终止反应。此时,标准品或有酒石酸酸性磷酸酶活性的孔会呈现不同深浅的
黄色。
7. 在405nm测定吸光度。如果不能测定405nm,也可以在400-415nm范围内检测吸光度。如果不能立即测定,
可以在数小时内完成测定,所显现的黄色在数小时内稳定。
8. 酸性磷酸酶活性单位的定义:在pH4.8,37℃条件下,每分钟水解para-nitrophenyl phosphate显色底物
产生1微摩尔p-nitrophenol所需的酸性磷酸酶的量定义为一个酶活力单位。
9. 根据酶活性定义,计算出样品中的抗酒石酸酸性磷酸酯酶活性。